Involvement of aquaporin-3 in melanoma

Tese de mestrado, Regulação e Avaliação do Medicamento e Produtos de Saúde, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A pele é o maior órgão do nosso corpo, uma vez que o cobre na totalidade e protege-nos de várias agressões exteriores, nomeadamente dos raios ultravioleta. Além disso, a pele permite com que o corpo mantenha a sua temperatura ótima para o seu funcionamento normal, vigilância imunológica e processos bioquímicos como a produção de Vitamina D3. A pele é constituída por várias camadas, derme, epiderme e hipoderme que são constituídas por células resistentes capazes de manter a fisiologia da pele, como a hidratação, a regulação da proliferação e diferenciação de queratinócitos e a cicatrização de feridas, que é suportada por proteínas chave como as aquaporinas (AQPs). As aquaporinas (AQPs) são canais proteicos transmembranares que facilitam os movimentos da água e de pequenos solutos através das membranas. As AQPs estão distribuídas por todo o corpo humano e são expressas de diferentes formas em diferentes tecidos. Várias isoformas de AQPs foram detetadas em diferentes tipos celulares presentes na pele onde desempenham papeis específicos e a sua desregulação tem sido associada a várias patologias da pele, nomeadamente o melanoma. Sabendo que a AQP3 (um canal de água, glicerol e peróxido de hidrogénio) está aberrantemente expressa no melanoma, e tirando partido do composto de ouro (III) Auphen reconhecido como potente inibidor da AQP3, esta tese de mestrado visa destacar a AQP3 como um potencial alvo terapêutico para o tratamento de doenças da pele, em particular o melanoma. Para atingir esse objetivo, a linha celular MNT-1 foi usada como modelo in vitro para o estudo do melanoma. Primeiramente, uma nova série de compostos de ouro resultante de modificações de Auphen (CCON, CNHN, CCH2N, STAM013, RBA29 e RBA31) foi testada quanto à sua citotoxidade, capacidade de bloquear a migração celular e efeito na permeabilidade das células MNT-1. No ensaio de permeabilidade apenas foram testados os dois inibidores que mais se destacaram nos ensaios de migração, CCON e Auphen. Foi testada a permeabilidade das células à água, ao glicerol e ao H2O2 usando um sistema de perfusão num microscópio de fluorescência. Todos os compostos, com a exceção do RBA29 e do RBA31, demonstraram ser não citotóxicos ou induziram menos de 20% da perda de viabilidade celular em concentrações inferiores a 5μM. O RBA29 e o RBA31 apresentaram toxicidade para as células MNT-1, causando morte celular. Quanto à migração celular, o composto CCON foi o inibidor que apresentou maior percentagem de inibição da migração (60%) seguido do CCH2N (53% de inibição). No entanto, o Auphen apresentou o maior efeito inibidor dos compostos de ouro testados. Relativamente à avaliação do efeito do Auphen e do CCON na permeabilidade da água, glicerol e do H2O2, a velocidade do influxo da água diminuiu quando as células foram tratadas com Auphen. A velocidade do influxo de glicerol diminuiu nas células tratadas com CCON e Auphen em relação ao controlo, no entanto, o Auphen apresenta um efeito inibidor mais potente. As células tratadas com ambos os inibidores apresentaram uma diminuição do influxo de H2O2. Com o objetivo de investigar o papel da AQP3 na inflamação e no stress oxidativo no melanoma, as células MNT-1 foram tratadas com três moléculas indutoras de stress: LPS e H2O2 para induzir o stress oxidativo, e TNF-α para induzir um fenótipo pró-inflamatório. Para modular a atividade da AQP3, as células fora não-tratadas e tratadas com Auphen e CCON. A expressão da AQP3 e de genes envolvidos na sinalização do cancro, transição epitelial-mesenquimal (EMT) e inflamação, foi avaliada por qPCR. A diminuição da expressão da MAPK cinases ERK1/2 foi consistentemente detectada em células cujas AQP3 estava bloqueada por Auphen, indicando que a AQP3 pode modular a via de sinalização EGFR/ERK MAPK. Estes resultados revelam o envolvimento da AQP3 na ativação de vias de sinalização tumoral no melanoma.Skin is the most vulnerable organ of the human body, constituting our first line of defense by covering the entire outer body surface. Additionally, skin has critical roles in thermoregulation, sensation, immunological surveillance, and biochemical processes such as Vitamin D3 production by ultraviolet irradiation. The ability of the skin layers and resident cells to maintain skin physiology, such as hydration, regulation of keratinocytes proliferation and differentiation and wound healing, is supported by key proteins such as aquaporins (AQPs). AQPs are transmembrane protein channels that facilitate the movements of water and small non-charged solutes across membranes. AQPs are widely distributed among the human body and differentially expressed in different tissues. Various AQP isoforms have been detected in different skin-resident cells where they perform specific roles, and their dysregulation has been associated with several skin pathologies, such as melanoma. Knowing that AQP3 (a water, glycerol, and hydrogen peroxide channel) is aberrantly expressed in melanoma and taking advantage of the well characterized gold (III) compound Auphen as potent AQP3 inhibitor, this master thesis aims to highlight AQP3 as a potential druggable target for the treatment of skin disorders, such as melanoma. For that, MNT-1 cell line was used as an in vitro model for studying melanoma. First, a new series of gold compounds resultant from Auphen modifications (CCON, CNHN, CCH2N, STAM013, RBA29 and RBA31) was tested for cytotoxicity, ability to block cell migration and inhibit permeability of melanoma MNT-1 cells. The effect of Auphen and CCON on water, glycerol and H2O2 permeability were tested using a perfusion system in a fluorescence microscope. All the compounds, except RBA29 and RBA31, showed to be harmless or induced less than 20% loss of cell viability at concentration below 5μM. RBA29 and RBA31 were toxic to MNT-1 cells. Regarding the cell migration assay, CCON was the strongest inhibitor showing 60% inhibition, followed by CCH2N (53% inhibition). Regarding the effect of Auphen and CCON on water, glycerol and H2O2 permeability, the water influx rate is reduced in cells treated with Auphen, comparing to non-treated cells. Glycerol influxes in Auphen- and CCON-treated cells were slower than in control cells, being Auphen the most potent inhibitor. Cells treated with Auphen and CCON showed lower H2O2 permeability. Aiming to investigate the role of AQP3 on inflammation and oxidative stress in melanoma, MNT-1 cells were treated with three stress-inductor molecules: LPS and H2O2 to induce oxidative stress, and TNF-α to induce a proinflammatory phenotype. In order to modulate AQP3 activity, cells were left untreated or treated with Auphen and CCON. The expression of AQP3 and genes involved in cancer signaling, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and inflammation, was assessed by qPCR. In cells treated with Auphen, downregulation of the MAP kinases ERK1/2 was consistently detected showing that AQP3 may alter the EGFR/ERK MAPK signaling pathway. This shows the involvement of AQP3 in the activation of tumor-associated signaling pathways in melanoma.Com o patrocínio do iMed, Faculdade de Farmácia - Universidade de Lisbo