Effects of newly detected synthetic cathinones on the central nervous system

Tese de mestrado, Qualidade Alimentar e Saúde, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Atualmente, cerca de 29% dos adultos relatam ter consumido substâncias ilícitas pelo menos uma vez ao longo da sua vida. Este facto demonstra o desafio que o consumo destas substâncias continua a ser para a saúde pública nos dias de hoje. A produção de substâncias ilícitas ocorre maioritariamente em países asiáticos, no entanto, a Europa continua a ser um local de produção de drogas de abuso e especialmente de tráfico das mesmas. Curiosamente, apesar do decréscimo no consumo de drogas ilícitas mais comuns, como por exemplo a heroína, as últimas duas décadas têm sido marcadas pela deteção de um maior número de novas substâncias psicoativas (NSP). Em 2020, foram identificadas 46 novas substâncias como pertencentes ao grupo das NSP, perfazendo um total de 830 compostos já identificados e monitorizados em países europeus. As NSP são um grupo composto por vários subgrupos. Entre eles, as catinonas sintéticas (CS) e os canabinoides sintéticos representam os maiores grupos dentro das NSP. As CS são sintetizadas a partir da catinona, um alcaloide com propriedades estimulantes encontrado nas folhas da planta khat (Catha edulis). A catinona é um β-ceto análogo da anfetamina que produz efeitos semelhantes a esta substância. Para além de serem consumidas pelo seu efeito estimulante, as CS são também utilizadas como alternativa a drogas de abuso mais comuns, incluindo cocaína, 3,4-metilenodioximetilanfetamina (MDMA), entre outras. Entre as razões mais comuns para o consumo destas substâncias estão, em primeiro lugar o seu estatuto legal, sendo vistas como alternativas legais devido à incorreta rotulagem dos produtos, e em segundo lugar, a sua disponibilidade, uma vez que estas substâncias são vistas como mais económicas e acessíveis especialmente através da internet. Estes compostos são frequentemente administrados em “binge”, o que se traduz por várias administrações repetidas num curto período de tempo, podendo durar até vários dias. O consumo de CS é mais comum em adolescentes e jovens adultos com idades entre os 15 e os 34 anos. A adolescência é um período marcado não só pelo desenvolvimento físico, mas também por alterações cognitivas e comportamentais. Desta forma, os adolescentes são mais propensos a comportamentos impulsivos e de risco, o que leva a uma maior tendência para o consumo de substâncias ilícitas. As alterações que ocorrem no sistema nervoso central (SNC) nesta fase de desenvolvimento, juntamente com o consumo de outras drogas de abuso ou álcool, podem resultar em alterações na estrutura e função cerebral levando eventualmente a danos irreversíveis. A 4-cloroetcatinona (4-CEC) está incluída no grupo das CS. Esta substância tem vindo a ser identificada em várias amostras apreendidas, tanto no seu estado puro, como misturada com outras substâncias, nos últimos anos. No entanto, há ainda pouca informação relativa a esta CS. A 4-CEC tem vindo a ser comparada ao MDMA, tendo demonstrado efeitos semelhantes ao mesmo. Como tal, é frequentemente utilizada como substituto deste composto especialmente por jovens em ambiente de festas noturnas. Esta CS, como outras drogas de abuso interage com transportadores de monoaminas para exercer os seus efeitos estimulantes. O impacto negativo da 4-CEC em linhas celulares humanas (neuronal e microglial) foi demonstrado pelo nosso grupo em modelos in vitro. Neste trabalho, com recurso a um modelo in vivo, tivemos como objetivo demonstrar os efeitos a curto e longo prazo de uma única administração em “binge” de 4-CEC e o seu impacto no SNC utilizando dois grupos de murganhos de diferentes idades: os jovens (1 mês de idade) e os adultos (6 meses de idade). Para isso, todos os animais foram submetidos a duas injeções, com duas horas de intervalo, de solução salina ou 4-CEC a 16 mg/kg (exposição em “binge”) no primeiro dia. Os testes cognitivos, com recurso ao labirinto aquático de Morris, foram iniciados 24 horas ou 1 mês após a exposição. Nos dias 7 ou 37 após a exposição à 4-CEC, depois da avaliação do comportamento emocional, os animais foram sacrificados e os cérebros recolhidos para estudos ex vivo. A análise ex vivo foi realizada para avaliar a expressão de transportadores de monoaminas, a neuroinflamação, com especial foco na reatividade glial e na expressão genética de marcadores inflamatórios, e a neuro-degeneração, através da análise da expressão genética de proteínas sinápticas e danos neuronais. Neste trabalho foi demonstrado que uma única administração em “binge” de 4-CEC a 16 mg/kg produz, a longo prazo, um atraso na capacidade de aprendizagem em ambos os grupos etários, um mês após a exposição. A exposição à 4-CEC também comprometeu a capacidade de memória a curto prazo em adultos, e a longo prazo em ambos os grupos etários. Porém, nos animais jovens a curto prazo, a ausência de sinal de memória no grupo de controlo condicionou a análise do grupo exposto à 4-CEC. As alterações ao nível da aprendizagem e memória foram transversais aos dois grupos etários avaliados. Todavia, isto não se verificou ao analisar o comportamento de ansiedade e depressão. Nos murganhos jovens, houve uma diminuição da ansiedade a curto e longo prazo bem como um aumento da apatia. No entanto, os murganhos adultos não demonstraram sinais de apatia após a administração de uma dose única em “binge” de 4-CEC, e o efeito ansiolítico descrito anteriormente foi visto apenas a longo prazo, um mês após a exposição. Adicionalmente, a administração de 4-CEC neste regime promoveu efeitos neurotóxicos através da alteração da expressão dos transportadores de monoaminas. Os transportadores de serotonina, dopamina e norepinefrina foram afetados de forma diferente. A exposição a 16 mg/kg de 4-CEC promoveu um aumento do transportador da serotonina no córtex de animais jovens e adultos, nomeadamente a longo prazo, bem como uma tendência de aumento no transportador da dopamina no hipocampo para ambos os tempos analisados, apesar da depleção a curto prazo no córtex. Relativamente ao transportador da noradrenalina, houve uma tendência para o seu aumento no córtex, hipocampo e cerebelo, com algumas variações para cada tempo estudado. Curiosamente, o hipocampo foi a única região marcada por um aumento a curto e longo prazo na expressão dos transportadores de monoaminas, comum a animais jovens e adultos. A exposição em “binge” à 4-CEC a 16 mg/kg promoveu reatividade ao nível dos astrócitos e microglia nos dois grupos etários, através de um aumento da expressão de GFAP e Iba1. O hipocampo demonstrou ser a região mais afetada pela exposição a esta CS, onde os efeitos foram mais evidentes ao fim de uma semana. No córtex de murganhos jovens também foi demonstrada a ativação dos astrócitos e microglia. Por outro lado, o cerebelo foi a região menos afetada nos dois grupos etários, não apresentando sinais de ativação destas células. A reatividade glial foi acompanhada de um aumento na expressão de citocinas. Enquanto que a expressão génica do fator de necrose tumoral (TNF)-α aumentou em jovens e adultos, nos dois períodos de tempo estudados, as interleucinas (IL)-1β e IL-10 mostraram apenas um aumento transitório na sua expressão, mais evidente em murganhos jovens. Por fim, esta CS promoveu ainda neuro-degeneração no hipocampo de murganhos jovens e adultos, um mês após a exposição em “binge” tendo sido mais evidente em animais jovens. Em conclusão, os nossos resultados demonstraram que a 4-CEC é capaz de provocar danos a curto e longo prazo no SNC resultando num comprometimento da capacidade cognitiva e alteração do comportamento emocional. Alterações ao nível da aprendizagem e capacidade de memória foram demonstradas um mês após a exposição em ambos os grupos etários. Estes resultados coincidem com a evidente presença de neuro-degeneração no hipocampo, uma região com um papel importante não só na memória, mas também na aprendizagem. Adicionalmente, os resultados apresentados sugerem uma maior suscetibilidade dos murganhos jovens aos efeitos de uma única administração em “binge” de 4-CEC a 16 mg/kg. Isto foi demonstrado por uma marcada presença de neuro-inflamação e neuro-degeneração neste grupo etário face aos adultos, o que pode justificar as alterações a nível emocional, incluindo apatia, apenas presente em murganhos jovens.New psychoactive substances (NPS) have been emerging in the drug market for the last two decades. Synthetic cathinones (SC) and synthetic cannabinoids represent the two major groups of substances within NPS. SC are synthesized from the main compound cathinone, a stimulant alkaloid found in the leaves of a plant known as khat (Catha edulis). Cathinone is a β-ketone analogue of amphetamine therefore eliciting similar effects. Besides being consumed for their stimulant effects, SC are often used as alternatives for common drugs of abuse, including cocaine, 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA), and others. Among the most common reasons to consume SC, users have mentioned legal status - often presumed as safe alternatives due to misleading labelling and availability (e.g., less expensive and easily acquired on the internet). Consumption of SC is more common in adolescents and young adults with ages between 15 to 34 years old and frequently in binge administration, that translates in multiple administrations within a short period of time, which can be repeated for several days. 4-chloroethcathinone (4-CEC) is a compound belonging to SC group. The negative impact of 4-CEC on human neuronal and microglial cell lines has been demonstrated by our group using in vitro models. Here, using an in vivo model we aimed to demonstrate the short- and long-term behavioural effects of a single binge exposure to 4-CEC and its impact on the central nervous system (CNS) using two groups of young (1-month) and adult (6-month) mice. For that, all mice were exposed to two injections separated by two hours of either saline or 4-CEC at 16 mg/kg – binge exposure – on the first day. Morris water maze (MWM) and behavioural testing occurred at two different time points, using different cohorts of mice, starting 24 hours or one month after exposure. After testing, brains were collected and ex vivo analysis was performed to assess monoamine transporters’ expression, neuroinflammation focusing on glia reactivity and gene expression of inflammatory markers, and neurodegeneration looking at gene expression of synaptic proteins and neuronal injury. We demonstrated that a single binge exposure to 4-CEC elicited long-term delayed learning ability and impaired memory capacity one month after administration in both young and adult mice. 4-CEC elicited, also, short-term impaired memory in adult mice, while in young animals the absence of memory signal, in the control group, conditioned the analysis. Moreover, young mice showed increased apathy and short- and long-term decreased anxiety. The administration of 4-CEC in a binge-like regimen promoted neurotoxic effects by altering the expression of monoamine transporters. This SC elicited astrocytes and microglia reactivity in both age groups accompanied by increased cytokine expression. Tumour necrosis factor (TNF)-α gene expression was increased in young and adult mice at both time points, however, for interleukin (IL)-1β and IL-10 there was only a transient overexpression, more evident in young mice. Lastly, this SC elicited neurodegeneration in the hippocampus of young and adult mice. Overall, our results showed that 4-CEC elicited short- and long-term deleterious effect on the CNS resulting in cognitive impairment and altered emotional behaviour. Furthermore, our findings suggested that young mice were more susceptible to the effects of a single binge administration of 4-CEC with a more evident neuroinflammation and neurodegeneration in this age group, what may justify the emotional alterations, namely apathy, only present in young animals.Com o patrocínio do Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, University of Lisbon e Fundação da Ciência e Tecnologia (FCT