Production of trehaloselipids towards anticancer application

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de FarmáciaNos dias de hoje, uma das principais preocupações no planeta é a transformação e preservação da Terra como um planeta sustentável. Tendo em conta esta preocupação com o meio ambiente, muitas indústrias estão gradualmente a mudar a visão global sobre o futuro do processo de fabrico. No caso dos surfactantes, que são compostos com várias propriedades e funções, como a capacidade de diminuir a tensão superficial entre substâncias, são produzidos principalmente por síntese química e estão atualmente a ser utilizados em grande escala em diversas indústrias. No entanto, estes compostos não são biodegradáveis e são bastante tóxicos para o meio ambiente. Assim sendo, a indústria atual começa, não só a perceber, como também, a utilizar o potencial das células vivas para um fabrico mais sustentável. Hoje em dia as células vivas são já utilizadas em alguns processos como é o caso do pré-tratamento de matérias-primas, das operações de processamento, das modificações de produtos, da gestão coletiva seletivo de resíduos, da reciclagem e da conservação de energia. Assim, as indústrias começam a substituir os surfactantes pelos biossurfactantes. Estes têm na sua composição uma parte hidrofílica que consiste em aminoácidos ou peptídeos, aniões ou catiões; mono-, di- ou polissacarídeos; e uma parte hidrofóbica que consiste em ácidos insaturados, saturados ou gordos. Os biossurfactantes, tal como os surfactantes têm a capacidade de diminuir a tensão superficial entre dois líquidos, entre um gás e um líquido, ou entre um líquido e um sólido. No entanto, podem ser produzidos por microrganismos a partir de recursos renováveis como solo, água ou óleos. Não se mantendo apenas a propriedades semelhantes aos surfactantes os biossurfactantes apresentam uma concentração micelar crítica entre dez e quarenta vezes mais baixa que a dos surfactantes sintéticos, o que quer dizer que uma menor quantidade de produto é precisa para que a tensão superficial diminuía. Acrescenta-se ainda que os biossurfactantes com um baixo peso molecular são mais suscetíveis a ter boas propriedades de superfície ativa, enquanto os de alto peso molecular são mais eficazes na estabilização de emulsões. De um modo geral, os biossurfactantes apresentam uma eficácia constante numa ampla faixa de temperatura e pH. Isto faz com que estas substâncias possam ser submetidas a condições extremas. No entanto, a produção de biossurfactantes em larga escala apresenta ainda algumas limitações, nomeadamente o alto custo de matéria-prima, o baixo rendimento e o alto custo de purificação. De um modo geral, os biossurfactantes podem ser divididos em cinco categorias principais, os glicolípidos, os ácidos gordos / fosfolipídios, os lipopeptídos / lipoproteínas, as partículas poliméricas e os surfactantes. Os glicolípidos são a categoria mais comum e por consequência a mais estudada entre os biossurfactantes, devido ao seu alto potencial de aplicação e alto rendimento de produção. Eles são glúcidos combinados com ácidos alifáticos de cadeia longa ou ácidos hidroxialifáticos. Os glicolípidos biossurfactantes apresentam excelentes propriedades tensoativas, incluindo a emulsificação, a dispersão, a solubilização, a formação de espuma, a penetração e a ação humectante. Os glicolípidos com um ou dois resíduos de açúcar ligados a diferentes estruturas lipídicas podem ser encontrados nas membranas celulares de bactérias, fungos, plantas e animais na forma de esterilglicosídeos, glicosilceramidas e diacilglicerolglicosídeos. Os glicolípidos podem ser divididos em várias categorias sendo as mais conhecidas os ramnolípidos, os soforolípidos, os trehaloselípidos e os manosileritritol lípidos. Os trehaloselipidos (TLs) são conhecidos por ter um dissacarídeo não redutor no qual as duas unidades de glucose estão ligadas por uma ligação α, α1, 1-glicosídica. Os TLs são normalmente produzidos por bactérias Gram-positivas com alto teor de guanina e citosina. Ao longo dos anos, estes compostos têm mostrado resultados em ambos os casos de inibição e aumento das taxas de biodegradação. Os TLs são capazes de reduzir a tensão superficial de soluções aquosas e a tensão interfacial entre as fases aquosa e oleosa para níveis semelhantes aos observados utilizando os surfactantes sintéticos. Com estas características, eles são capazes de atuar em diferentes indústrias. No que toca ao campo biomédico os TLs têm certas propriedades biológicas já conhecidas como as propriedades antimicrobianas, antivirais e antitumorais. Tendo tudo isto em conta, este trabalho tem como principal objetivo a otimização da produção de novos TLs quanto à origem do microrganismo, à composição do meio e às estratégias de condições de crescimento, bem como as condições de purificação e a avaliação da atividade biológica, como potenciais anticancerígenos. Dois microorganismos distintos foram selecionados para serem utilizados neste trabalho para a produção de TLs, Rhodococcus erythropolis e Rhodotorula sp. Rhodococcus erythropolis é uma bactéria gram-positiva já conhecida para a produção de TLs, ao inverso da Rhodotorula que se trata de uma levedura nunca antes usada com este propósito. As produções foram realizadas com diferentes meios, uma vez que a produção microbiana pode ser afetada por fatores como temperatura, fonte de carbono, fontes de nitrogénio, composição do sal e uso de extrato no caldo de cultura. Os meios usados foram à base de glucose e meio com diferentes sais, acrescentado que o meio tinha na sua composição, entre outros sais, carbonato de cálcio, que foi previamente provado eficaz na produção destes compostos. O meio salino foi testado com diferentes fontes de carbono. Essas fontes de carbono testadas foram a glucose, o glicerol, n-hexadecano e n-dodecano em concentrações de 2 e 4 % cada. A produção decorreu a uma temperatura constante de 28 ºC e uma rotação de 200 rpm durante 72 horas, para que fosse possível otimizar a produção de TLs. O crescimento foi otimizado às 48 horas para ambos os microrganismos com a grande maioria dos diversos meios a cultura. O consumo de glucose durante o crescimento em Rhodococcus erythropolis foi em cerca de 70 %, no entanto o da Rhodotorula dependeu bastante da concentração inicial de glucose. A extração foi efetuada por uma extração líquido-líquido utilizando uma solução à base de solvente de acetato de etilo e metanol, numa porção de 8:1, sendo depois de separada, levada a secar a parte biológica. Após a secagem, o composto foi pesado e submetido a uma série de testes para identificação e caracterização dos compostos produzidos. TLC e HPLC foram feitos para garantir a presença dos TLs nos compostos extraídos. Posteriormente, a condutância, a tensão superficial e a concentração micelar crítica foram medidas. Para testar sua atividade biológica, como agentes anticancerígeno, os TLs foram solubilizados em NaCl a 0,9 % (v/v) em diferentes concentrações e adicionados as células para o ensaio do MTS realizado em cancro do pulmão de células não pequenas, H1975 (NSCLC). No final do ensaio de MTS não foi possível observar um efeito citotóxico nas diferentes concentrações do composto dos dois microorganismos nesta linha celular. Pode-se assim concluir que os resultados obtidos no âmbito deste trabalho revelaram que a levedura de Rhodotorula sp é capaz de produzir TLs com propriedades semelhantes aos TLs produzidos pela Rhodococcus erythropolis. Contudo, não foi possível ver um efeito citotóxico claro nas diferentes concentrações dos compostos testados nesta linha celular de cancro do pulmão de células não pequenas. No entanto mais ensaios serão necessários de modo a elucidar sobre os mecanismos subjacentes e sobre a possibilidade de continuar a exploração de TLs como uma terapia anticancerígena em outras linhas celulares cancerosas no futuro, utilizando estes compostos produzidos naturalmente.Having in mind the current environmental concerns in the planet, it is known that it is necessary to investigate and invest in new biologic and eco-friendly compounds that are able to substitute pollutant chemicals. In this perspective, this work focused on the optimization of the production of new threhaloselipids (TLs) regarding the microorganism’s source, medium composition and strategies of growth conditions, as well as the purification conditions and evaluation of the biological activity, as anticancer agents. The TLs were produced by Rhodococcus erythropolis and Rhodotorula. This production was carried out with different media, glucose based media and salt media supplemented with glucose, glycerol, n-hexadecane or n-dodecane in different concentrations (2 and 4%). The production was optimized at 48h for both microorganisms, in order to increase the productivity of the TLs. The glucose consumption during the growth of R. erythropolis rounded the 70% but in Rhodotorula depended on the initial glucose concentration. For the first time Rhodotorula sp. was identified as a producer of trehaloselipids The extraction was performed through liquid-liquid extraction using a solvent based solution of ethyl acetate and methanol. After drying the solvent, the compound was submitted to a series of tests for the identification and characterization of the produced compounds. TLC, HPLC and UHPLC were the analytical methods used to ensure the presence of the developed TLs. Additionally, conductance, surface tension and critical micellar concentration were determined. To test their biological activity, as anticancer agents the TLs were solubilized in NaCl (0.9%) submitted to the MTS assay in H1975 non small cell lung cancer cells (NSCLC). It was not possible to observe any cytotoxic effects at the different concentrations of both compounds tested. Nevertheless, these results do not preclude the possibility of continuing the exploration of TLs as a cancer therapeutic in different cancer cells in the future.Com o patrocínio da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa