Modeling the transmission risk of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis across the mammal community of a Mediterranean agro-forestry farmstead

Tese de Mestrado em Biologia da Conservação, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2022Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the etiological agent of paratuberculosis, a chronic infection affecting ruminants worldwide. In wildlife, MAP was first detected in the European rabbit and has since then been reported in a very broad host range. Information on the ecological factors that increase infection risk, as well as evidence for the transmission paths linking livestock, wildlife, and the environment, remain scarce. Thus, the objectives of this thesis included estimating MAP prevalence in the mammal community of a Mediterranean agro-forestry farmstead, the Companhia das Lezírias, through field and wet lab approaches, assessing MAP’s spatial distribution, determining which factors modulate exposure of wildlife to MAP, and predicting MAP risk within the study area. Using molecular detection of IS900 as a proxy, MAP was detected in ten wild mammal species, with emphasis on wild rabbit (19% overall prevalence), in cattle (54% individual prevalence and 100% herd prevalence) and in soil (44% prevalence). Wildlife diversity showed a positive influence on MAP presence in mammal feces, while wildlife abundance showed a negative influence. Land use variables showed distinct degrees of influence on MAP presence in feces of specific groups of mammals: mixed forest showed positive influence in carnivores, and shrubland showed positive influence in wild rabbit. The spatial prediction of MAP occurrence risk in wildlife generated two hotspots; however, model accuracy was low. In conclusion, the variables considered were insufficient to accurately predict MAP occurrence risk in mammals in our study area, showing the need for further studies. Increasing the number of samples and sampled species, as well as considering new variables, could improve prediction accuracy. Despite these limitations, this study represents a significant step forward in the knowledge of MAP occurrence at the livestock-wildlife interface in a Mediterranean agroecosystem.Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) é o agente etiológico da paratuberculose ou doença de Johne, uma infeção crónica que afeta principalmente o sistema gastrointestinal. Esta doença pode causar diarreia, edema submandibular, perda de peso, desnutrição, anemia, letargia e, em casos mais graves, morte. No entanto, os animais podem permanecer assintomáticos durante dois a cinco anos. Os portadores assintomáticos não detetados podem contribuir significativamente para a transmissão de MAP, visto que excretam bactérias através do leite e dos dejetos, promovendo a infeção de outros animais e a contaminação do ambiente circundante. Os ruminantes domésticos parecem ser os hospedeiros preferenciais de MAP; no entanto, a infeção em ruminantes selvagens está também bem documentada. Para além de ruminantes, a presença de MAP foi detetada em coelho-bravo (Oryctolagus cuniculus) pela primeira vez na Escócia. Desde aí, vários estudos reportaram infeção num grande número de hospedeiros, incluindo aves e diversos taxa de mamíferos, como lagomorfos, carnívoros, roedores, ungulados e primatas. Também já se isolou MAP em invertebrados, como insetos e minhocas. Continua a haver pouca informação quanto aos fatores que aumentam o risco de infeção, assim como evidência sobre as vias de transmissão que ligam as interfaces animais de produção - animais selvagens - ambiente. Pensa-se que a infeção por MAP possa resultar do contacto com material fecal contaminado ou o consumo de leite e colostro contaminados, havendo também evidência de transmissão intrauterina e, potencialmente, transmissão por via aérea. A contaminação ambiental pode também ter um papel importante na transmissão indireta, visto que o solo e a água são reservatórios de bactérias excretadas por animais infetados. Há evidência de que estas bactérias conseguem sobreviver no solo durante cerca de um ano, dependendo das condições climatéricas a que estão sujeitas, e cerca de 36 semanas em água. A transmissão de MAP entre animais domésticos e selvagens pode ocorrer por diversas vias, dependendo dos hábitos alimentares de cada espécie. Os herbívoros poderão contrair a doença através do consumo de vegetação contaminada e os roedores através do consumo de ração contaminada. Já os carnívoros parecem contrair a doença indiretamente, através do consumo de presas infetadas. A transmissão entre animais selvagens e domésticos ocorre através do consumo de vegetação e ração contaminadas por herbívoros e roedores infetados. No entanto, segundo os estudos disponíveis, a excreção de MAP pelos animais selvagens não é significativa quando comparada com a dos animais de produção. Ainda assim, existe risco de introdução de MAP em manadas de bovinos não infetadas, através da contaminação ambiental. Pensa-se que MAP possa ter potencial zoonótico, dadas as semelhanças entre a paratuberculose nos mamíferos e a doença de Crohn nos humanos. Existe evidência que MAP consegue resistir aos processos de tratamento de água para consumo humano e à pasteurização, pelo que a transmissão ao Homem pode ocorrer através do consumo de água, leite ou outros laticínios contaminados. A paratuberculose é considerada endémica na maioria dos países da Europa, incluindo Portugal, onde há a necessidade de implementação de planos eficazes de vigilância e controlo. A infeção por MAP foi já confirmada em ruminantes domésticos de várias regiões do país, registando-se uma elevada prevalência ao nível das manadas. A infeção de animais selvagens foi também esporadicamente confirmada por estudos observacionais focados em diferentes espécies de mamíferos; no entanto, apenas um estudo recente focado em carnívoros abordou os potenciais fatores de risco. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar que variáveis podem promover a infeção por MAP entre animais de produção, animais selvagens e o ambiente usando como área de estudo uma exploração agrosilvo-pastoril, a Companhia das Lezírias (CL). Os objetivos incluíram estimar a prevalência de MAP na comunidade de mamíferos da CL através de trabalho de campo e abordagens moleculares; avaliar a distribuição espacial da ocorrência de MAP; testar, através de modelos lineares generalizados mistos (GLMMs), que fatores poderão modelar a exposição dos mamíferos a este microrganismo, e realizar inferências espaciais do risco de ocorrência de MAP na área de estudo. Recolheu-se 206 amostras de dejetos de 11 espécies de mamíferos, 80 amostras de solo, e 150 amostras de bovinos pertencentes a seis manadas. Usando a sequência de inserção IS900 como proxy, detetou-se MAP em amostras de 10 espécies de mamíferos (Erinaceus europaeus, Genetta genetta, Herpestes ichneumon, Lepus granatensis, Martes foina, Meles meles, Mustela nivalis, O. cuniculus, Sus scrofa e Vulpes vulpes), com uma prevalência global de 22%; em todas as manadas de bovinos, com uma prevalência individual de 54%; e em amostras de solo com 44% de prevalência. Este estudo é o primeiro a detetar MAP em ouriço-cacheiro (E. europaeus) em Portugal. Devido ao número limitado de amostras por espécie, não foi possível estimar a prevalência de MAP na maioria das espécies. As espécies com maior número de amostras foram o coelho-bravo (O. cuniculus) e a raposa (V. vulpes), com 62 e 37 amostras analisadas, respetivamente. Apesar de não ser uma espécie ruminante, o coelho-bravo é considerado um dos mais importantes hospedeiros na propagação de MAP, uma vez que pode excretar elevados níveis destas bactérias nos seus dejetos, promovendo a infeção de animais domésticos que consomem vegetação contaminada por estes dejetos. Neste trabalho, obtivemos 19% de amostras positivas de coelho-bravo e 22% de raposa. A elevada prevalência de MAP registada nas amostras de coelho-bravo pode estar na origem da prevalência observada na raposa e nos restantes carnívoros analisados, visto que o coelho-bravo é uma das principais presas dos mesocarnívoros em Portugal. A elevada prevalência de MAP observada nas amostras de bovinos e solo pode perpetuar a infeção de bovinos e representar um elevado risco de transmissão para os animais selvagens. Contrariamente ao esperado, a análise por GLMM sugeriu que a deteção de MAP no solo não influencia a presença de MAP em dejetos de mamíferos, o que pode estar relacionado com o limitado número de amostras analisado. Por outro lado, dada a natureza não-invasiva deste estudo em animais selvagens, desconhece-se a viabilidade de MAP (imprescindível para a infeção) nas áreas onde a sua presença foi detetada em DNA ambiental, pelo que não se pode concluir, com os dados atualmente disponíveis, qual o estatuto de infeção das populações nas áreas contaminadas. A diversidade de animais selvagens apresentou uma influência positiva na deteção de MAP nos mamíferos, enquanto a sua abundância mostrou uma influência negativa. Algumas variáveis relacionadas com o uso do solo exercem diferentes influências em grupos de mamíferos específicos: a cobertura de floresta mista teve uma influência positiva na presença de MAP em dejetos de carnívoros, enquanto a cobertura de habitat com predominância de vegetação arbustiva teve uma influência positiva na presença de MAP em dejetos de coelho-bravo. Surpreendentemente, a prevalência de MAP em bovinos mostrou uma influência negativa na presença de MAP em dejetos de lagomorfos. Este resultado inesperado pode advir da menor densidade de coelho-bravo nas zonas mais usadas pelos bovinos ou da distribuição heterogénea das amostras analisadas. A inferência espacial do risco de infeção por MAP nos mamíferos resultou em dois hotspots; no entanto, o modelo gerado a partir das variáveis significativas mostrou suporte insuficiente (AUC = 0.661). Concluímos assim que as variáveis consideradas na construção do modelo não foram suficientes para prever de forma exata o risco de infeção por MAP em mamíferos. Estudos adicionais serão necessários para realizar esta previsão na nossa área de estudo e, futuramente, a nível nacional. Seria benéfico aumentar o número de espécimes para cada espécie já amostrada, aumentar o leque de espécies, e considerar novas variáveis bióticas e abióticas. Também o aumento do número de amostras ambientais (solo, vegetação e cursos de água) e da sua distribuição espacial poderá fornecer pistas importantes em estudos futuros. Para além de uma abordagem molecular baseada na análise de DNA ambiental, sugerese uma abordagem cultural, por forma a demonstrar a viabilidade de MAP nas matrizes analisadas, apesar dos constrangimentos metodológicos para a cultura e isolamento desta bactéria fastidiosa. Este estudo permitiu um avanço do conhecimento sobre a distribuição de MAP na comunidade de mamíferos na Companhia das Lezírias, proporcionando oportunidades de intervenção, nomeadamente medidas de gestão de bovino infetados, aumentando também o nível de informação disponível à escala nacional. Acresce a confirmação da presença de MAP no solo, que poderá constituir uma potencial fonte de infeção de animais domésticos e selvagens