Development of a target therapy for fibrin clot breakdown

Tese de Mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasCardiovascular diseases (CVDs) are the major cause of death worldwide. In 2019, about 17.9 million people died from this disease, which can be caused by blood clots. These thrombi are made up of a mesh network of fibrin fibers. Fibrin polymerization begins with the enzymatic cleavage of fibrinopeptides, from fibrinogen molecule, giving rise to ‘knob-hole’ interactions, forming fibrin fibers that entangle and branch, producing a 3D fibrin clot. During fibrinolysis, plasminogen is converted to plasmin by tPA (tissue plasminogen activator). Then, plasmin cleaves fibrin fibers at specific locations. Under certain conditions, the clot structure formed can lead to thrombus that are resistant to fibrinolysis. In this situations, external intervention with thrombolytic agents is required. However, this clinical practice is associated with severe bleeding. The objective of this work is to produce an alternative therapeutic with lower risk of bleeding. We develop a liposome with encapsulated tPA, that targets the thrombus. Through different measurements we determined that in our POPC:Chol:DSPE-PEG-M:tPA:NS3 liposome there are ~10% of encapsulated tPA while the decoration with targeting NS3 peptide has a broad distribution. By using DLS and zeta-potential we found that the particle remains stable over the first 28 days after being produced. We tested the POPC:Chol:DSPE-PEG-M:tPA:NS3 in internal and external lysis of clots in vitro, where we saw that degradation of fibrin occurs. The initial velocity of plasmin formation in the presence of POPC:Chol:DSPE-PEG-M:tPA:NS3, after the addition of Triton X-100 (1%), increases about 2-fold. On ex vivo clots, the liposomes degraded partially the fibrin in the external lysis but did not degrade the clot in internal lysis. In general, we develop a targeted nanoparticle with encapsulated thrombolytic agent, that shows promising clot degradation in vitro but further studies and developed are needed.As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte, em todo o mundo. Estima-se que em 2019 morreram cerca de 17,9 milhões de pessoas devido a estas doenças, as quais derivam de diversos fatores, como por exemplo, de coágulos sanguíneos. Estes são constituídos principalmente por uma malha porosa de fibras de fibrina, a qual é formada a partir de uma proteína livre e em circulação, o fibrinogénio. A formação do coágulo, também designada de polimerização da fibrina, começa com a clivagem do fibrinogénio, pela trombina, expondo os knob ‘A’ e ‘B’. Estes knob interagem com os seus respetivos binding pockets (hole ‘a’ e ‘b’) de outra molécula de fibrina, formando-se interações knob hole ‘A-a’ e ‘B-b’. Estas interações permitem a formação de fibras que mais tarde ramificam produzindo um coágulo 3D de fibrina. A estrutura de um coágulo sanguíneo depende de diversos fatores, como por exemplo a concentração de fibrinogénio e de trombina. Elevadas concentrações de trombina produzem fibras mais finas, mais rígidas, as quais formam coágulos mais densos e, consequentemente, mais resistentes à fibrinólise. A degradação de um coágulo (fibrinólise) começa com a conversão enzimática do plasminogénio a plasmina, através do tPA (do inglês, tissue plasminogen activator). De seguida, a plasmina tem a capacidade de quebrar as fibras de fibrina em locais específicos, degradando assim os coágulos. Existem dois tipos de fibrinólise in vitro: a fibrinólise interna, que simula o processo de degradação do coágulo que ocorre fisiologicamente no organismo; e a externa, que simula a fibrinólise na prática clínica. No processo de fibrinólise interna, o fibrinogénio, a trombina, o plasminogénio e o tPA são misturados de modo a formar o coágulo e este se degradar à medida que o tPA converte o plasminogénio em plasmina. Por outro lado, na fibrinólise externa, o fibrinogénio é inicialmente misturado com a trombina, formando-se o coágulo. Após a formação do coágulo, o plasminogénio e o tPA são adicionados, produzindo-se a plasmina, que irá levar à fibrinólise. Em certas condições fisiológicas, o sistema fibrinolítico pode sofrer alterações, favorecendo o desenvolvimento de trombos. Nestes casos, é necessária a intervenção externa de agentes trombolíticos. Estes agentes atuam na ativação da plasmina, promovendo a degradação do coágulo. No entanto, este tipo de terapia encontra se associada a hemorragias severas, causadas pela ativação sistemática da plasmina inespecífica, ou seja, fora do local do coágulo. Como tal, é necessária a utilização de terapias alternativas mais direcionas e, portanto, mais seguras. Deste modo, o objetivo deste trabalho passou por desenvolver uma terapêutica segura e eficaz de transporte e entrega de agentes fibrinolíticos. Para tal, desenvolveu-se um lipossoma (POPC:Chol:DSPE-PEG-M), o qual irá ser utilizado na encapsulação do agente fibrinolítico, o tPA. Posteriormente, a superfície do lipossoma foi decorada com o péptido NS3, o qual assemelha-se à sequência do knob B, permitindo o direcionamento da nanopartícula por incorporação na estrutura do coágulo durante a sua formação. Este direcionamento para o coágulo permitirá a libertação do tPA no local do trombo, de forma controlada ao longo do tempo, evitando assim a ativação sistémica da plasmina. Desta forma, no final obteve-se a nanopartícula de estudo, o POPC:Chol:DSPE-PEG M:tPA:NS3. Em primeiro lugar determinou-se a concentração de tPA e de péptido NS3 existente nos lipossomas, para as quais se realizaram medidas colorimétricas e medidas de intensidade de fluorescência, onde se determinou que ~10% de tPA é encapsulado nos lipossomas e que a ligação do péptido NS3 na superfície dos lipossomas apresenta uma maior variabilidade. De modo a podermos caracterizar os lipossomas e verificar a sua estabilidade ao longo do tempo, realizaram-se medidas de dispersão dinâmica de luz e de potencial zeta. A partir das medições do diâmetro do lipossoma, observou-se que esta permanece estável ao longo dos primeiros 28 dias após a sua formação, aumentando de forma não significativa o seu diâmetro de 129,0 ± 0,4 nm para 130,0 ± 1,5 nm. Do mesmo modo, a homogeneidade das nanopartículas é mantida ao longo do tempo, onde o índice de polidispersão permanece abaixo de 0,2. Estes resultados mostram que tanto a encapsulação do tPA como a adição do péptido não afetam nem o tamanho nem a estabilidade do lipossoma. Com a adição do péptido NS3 o potencial-zeta passa de valores negativos (- 6,16 ± 0,51 mV) para 2,35 ± 0,23 mV. Esta diferença deve-se ao facto de o péptido NS3 possuir carga positiva, pela presença do resíduo de aminoácido Arginina, conferindo assim carga positiva à superfície do lipossoma POPC:Chol:DSPE-PEG-M:tPA:NS3. Verificou-se também que o potencial zeta diminuiu cerca de 2 mV ao longo do tempo, possivelmente devido à oxidação da ligação tioéster entre a maleimida e o NS3 ou devido à degradação da maleimida. De seguida, utilizando medidas de turbidez, estudou-se o efeito destes lipossomas na polimerização e na fibrinólise do coágulo in vitro. Na presença da lise interna, apurou-se que com o aumento da concentração de POPC:Chol:DSPE-PEG-M:tPA:NS3 existe um aumento da fase de latência (lag phase), o que poderá dever-se ao facto de o tPA estar a ser libertado ao mesmo tempo que o coágulo se forma e levar a que o tPA atrase a formação deste. Por outro lado, observou-se que o valor máximo de OD e o tempo de meia lise diminuíram significativamente, visto que associado ao aumento da concentração de lípido, e concomitantemente maior número de nanopartículas, existe um aumento da concentração de tPA, permitindo que este atue mais rapidamente na degradação das fibras. Na lise externa, o primeiro passo reflete a polimerização na ausência dos lipossomas e, como tal, observou-se que a fase de latência e o valor máximo de OD permanecem similares. No entanto, após a adição do POPC:Chol:DSPE-PEG-M:tPA:NS3, observou-se que o tempo de meia lise diminuiu com o aumento da concentração de lipossoma, como esperado, embora este tempo seja superior ao tempo de meia lise interna, visto que o lipossoma necessita de mais tempo para poder atravessar a malha do coágulo, assim como o tPA libertado necessita de se difundir pelo coágulo. Com isto, determinou-se a eficiência de encapsulação do agente trombolítico através da hidrólise do S-2251 pela plasmina, formando-se um produto colorimétrico. Esta experiência foi efetuada na ausência/presença de um detergente (Triton X 100), o qual quebra os lipossomas, libertando o seu conteúdo (neste caso, libertando o tPA). A velocidade de formação do produto colorimétrico na presença de POPC:Chol:DSPE-PEG-M:tPA:NS3 aumentou cerca de duas vezes, aquando da adição do Triton X-100 (1%), provando assim que o tPA se encontra encapsulado e que é libertado, exercendo a sua ação sobre a degradação do coágulo. Por fim, estudou-se a degradação de coágulos ex vivo, criados a partir de sangue de dadores saudáveis. Após 48 horas, verificou-se que ambos os controlos tiveram o comportamento esperado para ambas as lises, ou seja, no controlo positivo (tPA livre) ocorreu a degradação completa da fibrina e no controlo negativo não ocorreu a fibrinólise. Na lise externa observou-se que ocorreu o início da fibrinólise na presença dos lipossomas, mas esta não foi completa, ficando ainda coágulo por degradar. Por outro lado, na lise interna, não ocorreu a degradação do coágulo. No geral, neste trabalho foi possível desenvolver uma nanopartícula direcionada com o agente trombolítico encapsulado, estável ao longo dos primeiros 28 dias e com resultados preliminares na degradação de coágulos promovidos in vitro. O trabalho carece de mais estudos e melhoramentos na produção da nanopartícula e de maior evidência sobre a sua ação em coágulos mais complexos