Microscopie super-résolue tridimensionnelle par modulation du signal de fluorescence de molécules uniques

Three-dimensional imaging by localization of single molecules (SMLM) makes it possible to obtain resolutions of a few tens of nanometers, but still has certain limitations related in particular to non-uniform axial precision and a depth of observation often limited to the first micron of the sample. We propose here a new approach to single molecule localization, called ModLoc, which is based on the modulation and demodulation of the fluorescence signal of single molecules through the use of structured and time-modulated excitation. First, we present the fundamentals of SMLM imaging and the current limitations of this field. The subtleties of this new localization principle are then detailed and show a theoretical gain in precision by a factor of 3. Temporal emission studies of fluorescent probes in SMLM imaging reveal the need to integrate fast optical solutions (close to kHz). Experimental validation of the precision gain is demonstrated by the implementation of two optical devices. We choose to apply this principle in order to improve the accuracy of axial localization of fluorescent molecules. The results obtained show a uniform localization precision of 7.5 nm and up to 7 microns in depth on calibration samples and biological samples. The robustness of the method for in-depth MMS imaging is also demonstrated thanks in particular to acquisitions carried out at a depth of 30 µm in aberrant media. Various ways of improving the current device as well as the extension of this modulated localization approach to the observation of other quantities such as the life time and orientation of fluorescent molecules are proposed.L’imagerie tridimensionnelle par localisation de molécules uniques (SMLM) permet d’obtenir des résolutions de quelques dizaines de nanomètres mais présentent encore certaines limitations liées notamment à une précision axiale non uniforme et une profondeur d’observation souvent limitée au premier micron de l’échantillon. Nous proposons ici une nouvelle approche de localisation de molécules uniques, appelée ModLoc, qui repose sur la modulation et la démodulation du signal de fluorescence des molécules uniques via l’utilisation d’une excitation structurée et modulée temporellement. Dans un premier temps, nous exposons les fondamentaux de l’imagerie SMLM et les limites actuelles de ce domaine. Les subtilités de ce nouveau principe de localisation sont ensuite détaillées et montrent un gain de précision théorique d’un facteur 3. Des études du caractère temporel aléatoire de l’émission des sondes fluorescentes en imagerie SMLM révèlent la nécessité d’intégrer des solutions optiques rapides (proche du kHz). La validation expérimentale du gain en précision accessible est démontrée grâce à la mise en place de deux dispositifs optiques. Nous choisissons d’appliquer ce principe afin d’améliorer la précision de localisation axiale des molécules fluorescentes. Les résultats obtenus mettent en évidence une précision de localisation uniforme de 7.5 nm et jusqu’à 7 microns en profondeur sur des échantillons de calibrations et des échantillons biologiques. La robustesse de la méthode pour l’imagerie SMLM en profondeur est également démontrée grâce notamment à des acquisitions effectuées à 30 µm de profondeur dans des milieux aberrants. Différentes pistes d’amélioration du dispositif actuel ainsi que l’extension de cette approche de localisation modulée à l’observation d’autres grandeurs telle que le temps de vie et l’orientation des molécules fluorescentes sont proposées