Influence de paramètres physiques de nanotubes de carbone multi-parois sur leurs propriétés toxicologiques dans un modèle de cellules épithéliales bronchiques : rapprochement avec les effets pulmonaires chez le rat

In the era of nanotechnology, the use of multi-wall carbon nanotubes (MWCNT) is increasing. Inhalation exposure of workers during production, use or handling raises concerns about their adverse health effects due to their physico-chemical properties as well as their biopersistence. Because of their physical characteristics, they can easily reach the deep airways and deposit in the pulmonary epithelium. The aim of this thesis was to assess the influence of the diameter and length of MWCNT on their toxic effects.As a first approach, an in vitro experimental model based on exposure of human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) was developed. The cells were treated for 6 consecutive weeks with two MWCNT (0.125 to 1 µg/cm²) having different physical characteristics: NM-403 (short and thin) and Mitsui-7 (long and thick). After treatment, the cells were cultured for 4 additional weeks without treatment to assess the reversibility of the effects. From the first week of treatment with MWCNT, an increase in abnormal mitosis was observed. In addition, a genotoxicity test showed an increase in the number of cells harboring a micronucleus. Four to six weeks of treatment were required to reveal changes in cell morphology, suggesting a conversion from epithelial to mesenchymal state. This transition was confirmed by a decrease in the expression of two epithelial markers, E-cadherin and Claudine-1, and increased expression of mesenchymal markers N-cadherin, Vimentine and Fibronectine. After 4 weeks without treatment, we found that the previously induced epithelial-mesenchymal transition was partially reversible and that the degree of reversibility was dependent on the MWCNT.As a second approach, MWCNT-induced toxicity was evaluated in normal genotype (WT) and heterozygous rats for p53 (GMO). Following one intratracheal instillation per week for 4 consecutive weeks of Mitsui-7 or NM-403, two groups were euthanized: the first 3 days and the second 8 months after the last instillation. Three days post-exposure, acute pulmonary inflammation was observed with both MWCNTs and comparable between the 2 genotypes. Interestingly, the inflammation was persistent 8 months after exposure to NM-403, whereas it was resolved in the group exposed to Mitsui-7, independently of the genotype. Histopathological analyses did not reveal anytypical instersitial fibrosis. However, collagen deposition and granuloma formation were evident 8 months after exposure to both MWCNTs.While the genotype did not influence the effects induced by Mitsui-7 exposure, NM-403 induced more pronounced effects in GMO rats.À l'ère des nanotechnologies, l'utilisation des nanotubes de carbone multi-parois (MWCNT) s'accroît. L'exposition par inhalation des salariés lors de leur production, utilisation ou manipulation soulève des inquiétudes quant à leurs effets nocifs pour la santé. Les propriétés physico-chimiques de ces matériaux, ainsi que leur biopersistance interpellent quant à leurs effets toxiques. En raison de leurs caractéristiques physiques, ils peuvent aisément atteindre les voies respiratoires profondes et se déposer au niveau de l'épithélium pulmonaire. Cette thèse avait pour objectif d'évaluer l'influence du diamètre et de la longueur des MWCNT sur leurs effets toxiques.Dans une première approche, un modèle expérimental in vitro basé sur une exposition de cellules épithéliales bronchiques humaines (BEAS-2B) a été mis en place. Ainsi, les cellules ont été traitées pendant 6 semaines consécutives avec deux MWCNT (0,125 à 1 µg/cm²) ayant des caractéristiques physiques différentes : NM-403 (court et fin) et Mitsui-7 (long et épais). À la fin des 6 semaines, les cellules ont été maintenues en culture pendant 4 semaines supplémentaires sans traitement afin d'évaluer la réversibilité des effets. Dès la première semaine de traitement avec les MWCNT, une augmentation des mitoses anormales a été observée. De plus, un test de génotoxicité a mis en évidence une augmentation du nombre de cellules possédant un micronoyau. Quatre à six semaines de traitement ont été nécessaires pour induire des changements de la morphologie des cellules, suggérant une conversion de l'état épithélial à l'état mésenchymateux. Cette transition a été confirmée par une diminution de l'expression de deux marqueurs épithéliaux, la E-cadhérine et la Claudine-1, et une expression accrue des marqueurs mésenchymateux N-cadhérine, Vimentine et Fibronectine. Après 4 semaines sans traitement, il a été observé que la transition épithélio-mésenchymateuse précédemment induite était en partie réversible et que le degré de réversibilité était dépendant du MWCNT.Dans une deuxième approche, la toxicité induite par les MWCNT a été évaluée chez des rats de génotype normal (WT) et hétérozygotes pour p53 (OGM). Suite à une instillation intratrachéale par semaine pendant 4 semaines consécutives de Mitsui-7 ou de NM-403, deux groupes ont été mis à mort : le premier 3 jours et le deuxième 8 mois après la dernière instillation. À 3 jours post-exposition une inflammation pulmonaire aiguë a été observée avec les deux MWCNT et comparable entre les 2 génotypes. De manière intéressante, l'inflammation a été persistante 8 mois après exposition au NM-403, alors qu'elle a été résorbée dans le groupe traité avec le Mitsui-7, de manière indépendante du génotype. Les analyses histopathologiques n'ont pas mis en évidence de développement de fibrose interstitielle typique. Cependant, ces analyses ont révélé un dépôt de collagène ainsi que la formation de granulomes 8 mois après exposition au Mitsui-7 et au NM-403. De manière intéressante, alors que le génotype n'a pas influencé les effets induit par l'exposition au Mitsui-7, le NM-403 a induit des effets plus prononcés chez les rats OGM