Studio di una putativa proteasi nucleare essenziale per la cellula di lievito e conservata dagli archebatteri all'uomo

In questo lavoro analizziamo alcune caratteristiche della proteina Kae1 di Saccharomyces cerevisiae. Essa è codificata da un gene essenziale ed è classificata come metallo-proteasi in base all’omologia di sequenza con una O-Sialo-Glico-Endo-Peptidasi di Pasteurella haemolytica. Kae1, che è localizzata prevalentemente nel nucleo, fa parte di un complesso multi proteico al quale appartiene anche la proteina piD261/Bud32. Quest’ultima è una Ser-Thr protein chinasi appartenente ad una sub famiglia, molto conservata, originatasi prima della divergenza tra Archebatteri ed Eucarioti. Il suo ruolo nel lievito è essenziale per la normale crescita cellulare e anche l’omologo umano, PRPK, è probabilmente coinvolto nel controllo della crescita cellulare, dal momento che è in grado di fosforilare p53 in corrispondenza di Ser-15, evento che porta al blocco del ciclo cellulare in seguito a danni al DNA. Anche la sequenza di Kae1 è molto conservata ed il suo omolog umano è chiamato OSGEP. Qui mostreremo come PRPK e OSGEP siano omologhi funzionali delle corrispondenti proteine di lievito, grazie a saggi di complementazione fenotipica e anche che le due proteine PRPK e OSGEP sono in grado di interagire tra loro a supporto di un rilevante significato fisiologico di tale interazione. Dimostreremo inoltre che il mantenimento del motivo di legame al metallo HCIGH in Kae1 e OSGEP è correlato all’attività di tali proteine, dato che la sostituzione delle due istidine causa un fenotipo letale indistinguibile dalla delezione genica. Il nostro interesse è rivolto anche alla caratterizzazione del legame del metallo, data la particolarità della presenza inusuale di una cisteina nel motivo. L’aspettativa è quella di dimostrare l’attività catalitica in vitro della putativa proteasi Kae1 isolata da lievito e di confermare il legame dello ione metallico, definendo i residui coinvolti in tale legame, attraverso saggi di assorbimento atomico sulle proteine, di tipo selvatico e mutanti, espresse in E. coli