Analysis of the effect of the seasonality on sperm DNA fragmentation and characterization of the seminal microflora in the stallion

DNA fragmentation is a cause of infertility in stallions with apparent normal spermiograms. Factors behind DNA fragmentation are not always fully understood. Besides, seminal flora may have an effect on sperm quality, as well as predisposition to reproductive diseases. The objective of this thesis is to analyze the effect of seasonality on chromatin integrity, and to study seminal microbiota and factors affecting its variability in stallions. In Chapter 1.1 the effect of season (spring and summer) over some sperm quality parameters and fertility is studied. Progressive motility and DNA fragmentation have better values in spring. Also, fertility diminishes at the end of reproductive season. In Chapter 1.2 the objective was to fine-tune DNA fragmentation progress in refrigerated semen doses to different mathematical models in the four seasons of the year. Second order polynomial model better described DNA fragmentation in all seasons. Then, the evolution of DNA fragmentation was compared among seasons. In summer and winter, DNA fragmentation rate was slower than in spring in autumn. Chapter 2 is divided into Chapter 2.1 (Sections 2.1.1 and 2.1.2) and Chapter 2.2. In Section 2.1.1, the seminal microbiota of healthy stallions was characterized using next-generation sequencing. Inter-subject variability was observed. However, there was still four common phyla in all samples: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria and Proteobacteria. Besides, some bacterial families were common and abundant (>5%) in all stallions: Porphyormonadaceae, Corynebacteriaceae, Peptoniphilaceae and Prevotellaceae. In Section 2.1.2 the seminal microbiota assessment was performed in fertile stallions. Fertility was evaluated according to five sperm quality parameters: concentration, total number of spermatozoa, total motility, progressive motility and DNA fragmentation. No relevant inter-subject differences was observed. No correlation was either observed between families and sperm parameters. Chapter 2.2 is a case-study of a seminal flora shift in a contagious equine metritis carrier. It was observed that Corynebacteriaceae was the dominant family in semen when the animal hosted Taylorella equigenitalis. However, Porphyomonadaceae and Bacteroidetes phylum were more abundant when the stallion was free of the agent. In conclusion, according to the results of this thesis, seasonality affects sperm DNA fragmentation in the stallion in cooledstored semen. It has been shown that the fragmentation rate changes over seasons. Besides, the seminal microbiota in fertile stallions was mainly composed by Porphyormonadaceae, Corynebacteriaceae, Peptoniphilaceae and Prevotellaceae families. No correlation was observed between families and sperm parameters. However, flora composition was affected by the presence of Taylorella equigenitalis.La fragmentación del ADN espermático es una causa de infertilidad en sementales con espermiogramas normales. Dicha fragmentación está sujeta a diversos factores, no del todo dilucidados. Por otra parte, la microbiota del semen puede tener efecto sobre la calidad del semen o la predisposición a enfermedades. Por tanto, el objetivo de esta tesis es analizar la influencia del factor estacionalidad en la fragmentación espermática; y también estudiar la composición de la microbiota seminal, y su variabilidad entre individuos. En el Capítulo 1.1 se estudia el efecto de la época del año sobre varios parámetros de calidad seminal y la fertilidad. Se observa que la motilidad progresiva y la fragmentación espermática presentan mejores valores al inicio de la época reproductiva que al final. También se observa una disminución de la fertilidad al final de la temporada. En el Capítulo 1.2 se busca ajustar la evolución de la fragmentación espermática en dosis de semen refrigeradas tomadas durante las cuatro estaciones del año a tres modelos matemáticos diferentes. En todas las estaciones, el modelo que mejor define la evolución de la fragmentación en el tiempo es una función polinómica de segundo grado. Una vez elegido este modelo como el mejor, se compara el comportamiento de la evolución entre las estaciones, resultando que durante el verano e invierno la fragmentación evoluciona más rápidamente, en comparación con la primavera y otoño. El Capítulo 2.1 se subdivide en dos apartados. En el 2.1.1 se caracteriza la composición de la microbiota seminal de caballos fértiles empleando técnicas de secuenciación masiva. El resultado muestra una cierta variabilidad entre individuos, distinguir cuatro fila dominantes: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria. De entre todos ellos, algunas familias bacterianas muestran ser comunes en todos los individuos y encontrarse en proporciones altas (>5%). Estas familias son Porphyromonadaceae, Corynebacteriaceae, Peptoniphilaceae y Prevotellaceae. En el 2.1.2 se analizan la composición de la microbiota seminal en caballos y cinco parámetros de calidad seminal: concentración, número total de espermatozoides, motilidad total, motilidad progresiva y fragmentación espermática. No se observan diferencias significativas entre animales, ni correlación entre la abundancia de las familias bacterianas con los parámetros de calidad seminal. En el Capítulo 2.2 se presenta el caso de un cambio en la composición de la microbiota seminal en un semental al revertir su condición de portador del agente causante de la metritis equina contagiosa. Concretamente, la familia Corynebacteriaceae era dominante en el momento en que el semental era portador de Taylorella equigenitalis; mientras que Porphyromonadaceae, y en general el filo Bacteroidetes, era el más abundante cuando el agente desapareció. En conclusión, de acuerdo con los resultados de esta tesis, la estacionalidad tiene efecto en la integridad del ADN del espermatozoide equino en dosis de semen refrigeradas, modificando también la velocidad a la que se degrada. Por otra parte, se ha observado que en la microbiota seminal dominan las familias Porphyromonadaceae, Corynebacteriaceae, Peptoniphilaceae y Prevotellaceae. No se ha observado influencia de la composición de la microbiota con los parámetros de calidad seminal; sin embargo, sí se ha observado en el caso de un portador de Taylorella equigenitalis