Epidemiological surveillance in lagomorphs in Andalusia

La vigilancia epidemiológica se define como la recolección sistemática, análisis e interpretación de datos sanitarios necesarios para la planificación, implementación y evaluación de medidas de lucha frente a las enfermedades, así como la difusión de la información generada. En veterinaria, la vigilancia epidemiológica aborda el conocimiento continuo y sistemático del estatus sanitario de las poblaciones animales, así como de los factores de riesgo a los que están expuestas las poblaciones. Según la metodología de obtención de información, la vigilancia puede clasificarse en activa o pasiva. Esencialmente, la vigilancia epidemiológica activa trata de medir o cuantificar la presencia de un determinado patógeno en una población, mientras que la vigilancia epidemiológica pasiva se sustenta en la comunicación de cualquier sospecha de enfermedad para determinar el agente etiológico implicado. Con el objetivo de establecer las medidas de prevención y lucha adecuadas en cada momento, un programa de vigilancia epidemiológica (ya sea activa o pasiva) debe ser dinámico y estar sujeto a modificación constante. En la actualidad, los programas de vigilancia epidemiológica que se realizan en Europa son numerosos y se encuentran bien establecidos tanto para los seres humanos como para animales domésticos. En humanos, las primeras medidas que pueden considerarse como acciones de vigilancia, tuvieron lugar durante las grandes epidemias que afectaron a Europa en los siglos XIV y XV, aunque los programas como tal se desarrollaron mucho más tarde, en la segunda mitad del siglo XX. En paralelo, debido al estrecho contacto entre las personas y los animales domésticos, estos programas fueron surgiendo también en ganadería. Sin embargo, el interés por la vigilancia de las enfermedades en fauna silvestre es mucho más reciente. En España, los primeros programas de vigilancia comienzan a desarrollarse a finales de siglo, en los años 80. A partir de ese momento se incrementa el interés por conocer el papel epidemiológico de la fauna silvestre en la transmisión de enfermedades relevantes para su conservación, así como para la sanidad animal y la salud pública, y con ello, la necesidad de desarrollar programas de vigilancia orientados también a estas especies. Las especies de lagomorfos silvestres más relevantes en la Península Ibérica, en términos de abundancia e interés cinegético, son el conejo silvestre (Oryctolagus cuniculus) y la liebre ibérica (Lepus granatensis). Entre las principales causas implicadas en la modulación de sus poblaciones se encuentran las enfermedades infectocontagiosas. En este sentido, la Enfermedad Hemorrágica del Conejo (EHC) y la mixomatosis destacan como los principales factores responsables del declive poblacional de estas especies en la última década. La aparición de la nueva variante del virus de la EHC (GI.2) o las modificaciones genéticas del virus de la mixomatosis (ha-MYXV), han ocasionado cambios importantes en la epidemiología y patogenia de estas enfermedades víricas. El estudio de estos nuevos escenarios requiere de la implementación de programas de vigilancia sanitaria que permitan detectar de forma rápida (mediante vigilancia pasiva) la circulación de estos virus, monitorizar (empleando vigilancia activa) su distribución y evolución espacio-temporal, y evaluar su impacto en las poblaciones de lagomorfos silvestres en los ecosistemas mediterráneos ibéricos. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es ampliar el conocimiento sobre las principales enfermedades víricas (EHC y mixomatosis) que han afectado al conejo silvestre y a la liebre ibérica en la Península en la última década. Para ello, se han desarrollado varios estudios distribuidos en cuatro capítulos. En el Capítulo 1 se llevó a cabo un programa de vigilancia pasivo para monitorizar los brotes de GI.2 en las poblaciones de conejo silvestre en Andalucía durante el periodo 2013-2017. En este estudio se analizaron un total de 96 cotos de caza menor o zonas protegidas en las que se detectó elevada mortalidad. El primer brote se observó en junio de 2013. El número de brotes aumentó considerablemente en 2013 y 2014, observándose una tendencia decreciente durante los años siguientes. La distribución espacial de GI.2 no fue homogénea, ya que la mayoría de los brotes se detectaron en la zona occidental de la región. Se confirmó circulación de GI.2 en los cinco años evaluados, detectándose la mayoría de los brotes en los meses de invierno y primavera. Durante el periodo de estudio, se obtuvieron muestras de hígado de 190 conejos encontrados muertos en 87 de las 96 áreas analizadas. Los análisis moleculares confirmaron la presencia de ARN de GI.2 en muestras de 185 de los 190 (97,4%) conejos analizados. El estudio filogenético realizado en 11 muestras de hígado obtenidas en diferentes provincias entre 2013 y 2017 reveló una elevada homología genética con las cepas de GI.2 detectadas previamente en España, Francia y Portugal. Los resultados obtenidos sugieren una amplia distribución espacial y una circulación endémica de GI.2 en las poblaciones de conejo silvestre en Andalucía durante el periodo 2013- 2017. Nuestro estudio constituye un paso importante para comprender la emergencia y propagación de GI.2 en el este de España y proporcionarán información relevante para el desarrollo de programas de vigilancia en Europa. El objetivo del Capítulo 2 fue establecer un programa de vigilancia epidemiológica activa para determinar la seroprevalencia del virus de la mixomatosis (MYXV), la prevalencia de infección de este virus, así como los patrones espaciotemporales y factores de riesgo asociados a su circulación en las poblaciones de conejo silvestre en ecosistemas mediterráneos del sur de España. Para ello, se muestrearon un total de 2376 animales durante cuatro periodos temporales: 2009- 2012 (P1), 2012-2015 (P2), 2015-2018 (P3) y 2018-2021 (P4). Se encontraron anticuerpos frente al MYXV en el 59,6% (1424/2376; IC95%: 58,0-61,9%) de conejos silvestres utilizando un ELISA indirecto comercial. Se detectó al menos un animal seropositivo en 131 (96,3%) de los 136 cotos de caza menor muestreados. Se confirmó infección por MYXV en 94 de 1063 (8,8%; IC95%: 7,3- 10,7) conejos mediante PCR. No se encontró circulación del MYXV recombinante de la liebre (ha- MYXV) en los conejos silvestres analizados durante P4, periodo de comienzo de circulación de este virus emergente en las poblaciones de liebre ibérica. Se identificaron cinco clústeres espaciotemporales estadísticamente significativos de alta seroprevalencia utilizando un modelo de Bernoulli; uno en el P2 y cuatro en el P3. El análisis, empleando modelo lineal generalizado mixto para la seropositividad al MYXV, identificó la temporada (otoño), la edad (adulto y subadulto), los brotes de mixomatosis durante el mes anterior al muestreo, la temperatura media anual y la seropositividad al Virus de EHC como potenciales factores de riesgo. De forma similar, los brotes de mixomatosis durante el mes anterior al muestreo, la seropositividad a MYXV y la presencia de lesiones compatibles con mixomatosis fueron factores asociados con la infección por MYXV. Los resultados indican una elevada exposición, una distribución generalizada pero no homogénea y una circulación endémica de MYXV en las poblaciones de conejos silvestres en Andalucía durante la última década. La prevalencia de anticuerpos frente al MYXV presentó fluctuaciones durante el año y a lo largo de los periodos de estudio, mostrando variaciones en la inmunidad de las poblaciones de conejos silvestres en los ecosistemas mediterráneos, lo que podría incrementar el riesgo de re-emergencia del MYXV en poblaciones inmunológicamente desprotegidas. El presente estudio destaca la importancia de la vigilancia activa a largo plazo para una mejor comprensión de la epidemiología del MYXV en lagomorfos silvestres. En el Capítulo 3 se describe el primer brote de mixomatosis en liebre ibérica. Entre mediados de julio y finales de septiembre de 2018 se detectaron alrededor de 530 animales muertos en Andalucía. La tasa de mortalidad media aparente fue del 56,7% y la tasa de letalidad media estimada fue del 69,2%. Los resultados histopatológicos y moleculares confirmaron la infección por ha-MYXV en todas las liebres analizadas. Desde nuestro conocimiento, este es el primer brote de mixomatosis que causa una elevada mortalidad en liebres y la primera descripción de un brote de mixomatosis en la liebre ibérica. La ausencia de casos en conejos silvestres simpátricos sugiere diferencias en la susceptibilidad entre ambas especies de lagomorfos a la cepa del virus implicada en el brote. Tras el primer caso, el número de zonas afectadas aumentó considerablemente afectando a la mayor parte de la Península Ibérica donde está presente la liebre ibérica. El objetivo del Capítulo 4 fue describir la evolución espacio-temporal y los principales hallazgos epidemiológicos de los brotes causados por ha-MYXV en liebre ibérica en España. En el periodo 2018-2020, se confirmó mediante PCR, la infección por MYXV en un total de 487 liebres ibéricas procedentes de 372 áreas. Se detectaron brotes de ha-MYXV en la mayoría de las regiones españolas donde habita la liebre ibérica. La distribución espacial no fue homogénea, concentrándose la mayoría de los brotes en el sur y centro de España. La detección de brotes consecutivos durante 2019 y 2020, sugieren una circulación endémica en España de este virus emergente. El estudio retrospectivo realizado justo después del primer período epidémico (2018- 2019) reveló que el virus podría haber estado circulando desde junio de 2018. El número de brotes comenzó a aumentar en julio, alcanzando su pico epidémico durante la primera quincena de agosto y octubre, y disminuyó bruscamente hasta enero de 2019. La tasa de mortalidad media aparente fue del 55,4% (mediana: 70,0%). Los resultados obtenidos indicaron una elevada susceptibilidad de la liebre ibérica a la infección por ha-MYXV, pero una aparente resistencia en las especies de liebres presentes en España y una limitada circulación del ha-MYXV en las poblaciones de conejo silvestre. El ha-MYXV ha tenido un importante impacto en el estado sanitario de las poblaciones de liebre ibérica en España, con las consecuentes implicaciones para la sanidad animal y la conservación de esta especie. El presente estudio contribuye a una mejor comprensión de la epidemiología del ha-MYXV y proporcionará información relevante para el desarrollo de medidas de control frente a este virus emergente. En esta Tesis Doctoral se aportan nuevos conocimientos sobre las dos enfermedades infecciosas (mixomatosis y EHC) que mayor impacto han tenido en las poblaciones de conejo silvestre y liebre ibérica en la Península Ibérica durante la última década. Los resultados obtenidos proporcionan una visión general sobre la evolución espacio-temporal de estas enfermedades infecciosas y resaltan la importancia de los programas de vigilancia pasiva y activa para una mejor comprensión de la epidemiología del GI.2, MYXV y ha-MYXV.Epidemiological surveillance is defined as the systematic collection, analysis, and interpretation of health data necessary for the planning, implementation, and evaluation of disease control measures, together with the dissemination of the information generated. In the veterinary field, epidemiological surveillance is directed at providing systematic ongoing information about the health status of animal populations and the risk factors to which these populations are exposed. Depending on the methodology used to gather information, surveillance can be classified as active or passive. Essentially, active surveillance aims to measure or quantify the presence of a given pathogen in a population, whereas passive surveillance involves the rapid reporting of any suspected disease and investigating the causative agent. In order to establish the appropriate prevention and control measures at any given time, epidemiological surveillance programmes (both active and passive) should be dynamic and subject to constant adjustment. Nowadays, there are numerous well-established epidemiological surveillance programmes in Europe for both human beings and domestic animals. In the case of humans, the first surveillance measures were instituted during the major epidemics that affected Europe in the 14th and 15th centuries, although surveillance programmes as such only developed much later, in the second half of the 20th century. In parallel, epidemiological surveillance programmes started to be developed to survey the health of domestic animals, due to their close contact with humans. Interest in wildlife disease surveillance, however, is a much more recent phenomenon. In Spain, the first surveillance programmes began to be developed in the 1980s. Interest subsequently focussed on the epidemiological role of wildlife species in the transmission of diseases of relevance to their conservation, as well as to animal and public health. As a result, surveillance programmes evolved to include these species as well. The main wild lagomorph species in the Iberian Peninsula in terms of abundance and hunting interest are European wild rabbits (Oryctolagus cuniculus) and Iberian hares (Lepus granatensis), although populations have been declining over the last decade. Rabbit haemorrhagic disease (RHD) and myxomatosis are among the main factors involved in the regulation of their populations and are also the main ones explaining the current decline of their populations. The appearance of the new variant of RHD virus (GI.2) and the genetic modifications of myxoma virus (ha-MYXV) have led to important changes in the epidemiology and pathogenesis of these viral diseases. To study these new scenarios, it is necessary to implement health surveillance programmes that can rapidly detect (by passive surveillance) the circulation of these viruses, monitor (by active surveillance) their distribution and spatiotemporal evolution, as well as assess their impact on wild lagomorph populations in Mediterranean ecosystems. The overall objective of this PhD thesis is to increase knowledge about the main viral diseases (RHD and myxomatosis) that have affected wild rabbits and Iberian hares in the Iberian Peninsula over the last decade. With this purpose in mind, several studies were developed and are presented here under four main headings. Chapter 1: A passive surveillance programme was conducted to monitor outbreaks of GI.2 in wild rabbit populations in Andalusia between 2013 and 2017. This study included a total of 96 game estates or protected areas where high mortality rates were detected. The first outbreak of GI.2 was notified in June 2013. While the number of outbreaks increased sharply in 2013 and 2014, a decreasing trend was observed in the following years. The spatial distribution of GI.2 was not homogeneous, with most outbreaks being detected in the westernmost part of the region. Circulation of GI.2 was confirmed in all five years evaluated, with most outbreaks being detected in the winter and spring months. During the study period, liver samples were obtained from 190 rabbits found dead in 87 of the 96 areas tested. Molecular analysis confirmed the presence of GI.2 RNA in samples from 185 of the 190 (97.4%) rabbits tested. The phylogenetic analysis conducted on 11 liver samples obtained from different provinces between 2013 and 2017 revealed high genetic homology with GI.2 strains previously detected in Spain, France, and Portugal. The results obtained suggested a wide spatial distribution and endemic circulation of GI.2 in wild rabbit populations in Andalusia between 2013 and 2017. Our study represents an important step towards understanding the emergence and spread of GI.2 in Andalusia and provides information relevant to the development of surveillance programmes in Europe. Chapter 2: The aim of this study was to establish an active epidemiological surveillance programme to determine myxoma virus (MYXV) seroprevalence and the prevalence of infection, as well as the spatiotemporal patterns and factors associated with its circulation in wild rabbit populations in the Mediterranean ecosystems of southern Spain. A total of 2,376 animals were sampled over four time periods: 2009-2012 (P1), 2012-2015 (P2), 2015-2018 (P3) and 2018-2021 (P4). Antibodies against MYXV were detected by a commercial indirect ELISA in 59.9% (1,424/2,376; 95%CI: 58.0-61.9) of wild rabbits. At least one seropositive animal was detected on 131 (96.3%) of 136 game estates sampled. MYXV infection was confirmed by PCR in 94 of 1,063 (8.8%; 95%CI: 7.3-10.7) wild rabbits. Infection with recombinant MYXV (ha-MYXV) was not found in any wild rabbits tested in P4, the period when ha-MYXV emerged in the Iberian hare. Five statistically significant spatiotemporal clusters of high seroprevalence were identified using a Bernoulli model: one in P2 and four in P3. A generalized linear mixed model (GLMM) analysis identified sampling season (autumn), age (adults and juveniles), outbreaks of myxomatosis in the month prior to sampling, mean annual temperature, and seropositivity to rabbit haemorrhagic disease virus as factors potentially linked with MYXV seropositivity. GLMM analysis identified outbreaks of myxomatosis in the month prior to sampling, MYXV seropositivity and the presence of lesions compatible with myxomatosis as factors associated with MYXV infection. The results indicate high exposure, widespread but non-homogeneous distribution, and endemic circulation of MYXV in wild rabbit populations in southern Spain over the last decade. Prevalence of antibodies against MYXV showed fluctuations both within the year and over the study periods, revealing variations in the immunity of wild rabbit populations in Mediterranean ecosystems that could increase the risk of MYXV re-emergence in immunologically naïve populations. The present study highlights the importance of long-term surveillance to obtain a better understanding of the epidemiology of MYXV in wild lagomorphs. Chapter 3: This study describes the first outbreak of myxomatosis in Iberian hares. Between mid-July and the end of September 2018, about 530 animals were found dead in Andalusia. The mean apparent mortality rate was 56.7% and the estimated mean case-fatality rate was 69.2%. Histopathological and molecular results confirmed ha-MYXV infection in all hares tested. To the best of our knowledge, this was the first outbreak of myxomatosis to cause high mortality in hares and the first description of a myxomatosis outbreak in Iberian hares. The fact that no cases were reported in sympatric wild rabbits suggests differences in susceptibility to ha-MYXV between the two lagomorph species. After the first cases, the number of affected areas increased considerably, and most of the Iberian Peninsula where the Iberian hare is present is currently involved. Chapter 4: The objective of this study was to describe the spatiotemporal evolution and main epidemiological findings of outbreaks caused by ha-MYXV in Iberian hares in Spain. Between 2018 and 2020, MYXV infection was confirmed by PCR in a total of 487 hares from 372 areas. Outbreaks of ha-MYXV were detected in most Spanish regions where the Iberian hare is present. Spatial distribution was not homogeneous, with most outbreaks being concentrated in south and central areas of the country. The detection of consecutive outbreaks in 2019 and 2020 suggests an endemic circulation of this emerging virus in Spain. This retrospective study conducted soon after the first epidemic period (2018-2019) revealed that the virus may have been circulating since June 2018. The number of outbreaks started to increase in July of that year, reaching its epidemic peak between the first half of August and October, and then declined sharply until January 2019. The mean apparent mortality rate was 55.4% (median: 70.0%). The results obtained indicate high susceptibility of Iberian hares to ha-MYXV infection, but apparent resistance in other hare species present in Spain, and limited circulation of ha-MYXV in wild rabbit populations. ha-MYXV has had a major impact on the health status of Iberian hare populations in Spain, with corresponding implications for the health status and conservation of this species. The present study provides new insights into the epidemiology of ha-MYXV and information relevant to the development of control measures against this emerging virus. The results of this doctoral thesis present new knowledge on the two infectious diseases (myxomatosis and RHD) that have had the greatest impact on wild rabbit and Iberian hare populations in the Iberian Peninsula over the last decade. The results obtained provide an overview of the spatiotemporal evolution of these infectious diseases and highlight the importance of passive and active surveillance programmes in order to obtain a better understanding of the epidemiology of GI.2, MYXV and ha-MYXV