Sistemas no virales basados en niosomas como nuevas herramientas para la transferencia génica de células senescentes

[Resumen] El envejecimiento consiste en un proceso complejo que se caracteriza por la acumulación de células senescentes en los tejidos y órganos, produciendo el deterioro del funcionamiento del organismo con la edad. La senescencia celular es un proceso causado por un daño permanente en el ADN que conlleva a la pérdida de la capacidad de proliferación celular y que se asocia con enfermedades relacionadas con la edad como la osteoartritis. Con ello, hay un creciente interés en la formulación de modelos de células senescentes in vitro como medio para investigar nuevas dianas terapéuticas enfocadas a desarrollar tratamientos más eficaces para estas patologías. En concreto, la terapia génica de células madre mesenquimales (MSC) ha surgido como una herramienta prometedora para aumentar el potencial terapéutico de esta población celular. En los últimos años, se han estudiado diversos vectores basados en sistemas virales y no virales para la transferencia de genes terapéuticos. Sin embargo, la elevada citotoxicidad de estos vectores sumada a la alta sensibilidad de las células senescentes limita su utilización con fines de investigación biomédica. Con objeto de superar estas limitaciones, se han desarrollado los niosomas, vectores no virales autoensamblados con un rendimiento prometedor para la entrega de genes en comparación con los más ampliamente estudiados, liposomas. De este modo, el objetivo del presente estudio fue desarrollar vehículos de administración de genes basados en niosomas en MSCs senescentes aisladas del estroma de cordón umbilical (hUC-MSCs). Para ello, se desarrolló un modelo de senescencia basado en el empleo del fármaco inhibidor de Cdks4/6, Palbociclib sobre las hUC-MSCs. Se prepararon dos formulaciones de niosomas conteniendo 1,2-di-O-octadecenil-3- trimetilamonio propano (DOTMA) como lípido catiónico, colesterol o escualeno como lípido auxiliar y polisorbato 60 y poloxámero como tensioactivos no iónicos. La eficiencia de transfección y perfil citotóxico de los niosomas complejados con el plásmido pGL4.14[luc2/Hygro] conteniendo el gen reportero luciferasa fue analizada en hUC-MSCs (senescentes y no senescentes) y comparada con las obtenidas con el liposoma comercial Lipofectamina. Los resultados obtenidos mostraron que los complejos niosoma-plásmido (nioplejos) presentaron características fisicoquímicas apropiadas para la transfección celular de hUC-MSCs senescentes y no senescentes, siendo los nioplejos de colesterol formados a relación DOTMA/pADN de 5 los más eficientes. Además, ninguna de las formulaciones desarrolladas resultó citotóxica como vehículo de transfección de hUC-MSCs.[Resumo] O envellecemento consiste nun proceso complexo que se caracteriza pola acumulación de células senescentes nos tecidos e órganos, producindo a deterioración do funcionamento do organismo coa idade. A senescencia celular é un proceso causado por un dano permanente no ADN que conleva á perda da capacidade de proliferación celular e que se asocia con enfermidades relacionadas coa idade como a osteoartritis. Con iso, hai un crecente interese na formulación de modelos de células senescentes in vitro como medio para investigar novas dianas terapéuticas enfocadas a desenvolver tratamentos máis eficaces para estas patoloxías. En concreto, a terapia xénica de células nai mesenquimales (MSC) xurdiu como unha ferramenta prometedora para aumentar o potencial terapéutico desta poboación celular. Nos últimos anos, estudáronse diversos vectores baseados en sistemas virais e non virais para a transferencia de xenes terapéuticos. Con todo, a elevada citotoxicidad destes vectores sumada á alta sensibilidade das células senescentes limita a súa utilización con fins de investigación biomédica. Con obxecto de superar estas limitacións desenvolvéronse os niosomas, vectores non virais autoensamblados cun rendemento prometedor para a entrega de xenes, en comparación cos máis amplamente estudados, liposomas. Deste xeito, o obxectivo do presente estudo foi desenvolver vehículos de administración de xenes baseados en niosomas en MSCs senescentes illadas do estroma de cordón umbilical (hUC-MSCs). Para iso, desenvolveuse un modelo de senescencia baseado no emprego do fármaco inhibidor de Cdks4/6, Palbociclib sobre as hUC- MSCs. Preparáronse dúas formulacións de niosomas contendo 1,2-dei-Ou- octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) como lípido catiónico, colesterol ou escualeno como lípido auxiliar e polisorbato 60 e poloxámero como tensioactivos non iónicos. A eficiencia de transfección e perfil citotóxico dos niosomas complexados co plásmido pGL4.14[luc2/Hygro] contendo o xene reporteiro luciferasa foi analizada en hUC-MSCs (senescentes e non senescentes) e comparada coas obtidas co liposoma comercial Lipofectamina. Os resultados obtidos mostraron que os complexos niosoma-plásmido (nioplexos) presentaron características fisicoquímicas apropiadas para a transfección celular de hUC-MSCs senescentes e non senescentes, sendo os nioplexos de colesterol formados á relación DOTMA/pADN de 5 os máis eficientes. Ademais, ningunha das formulacións desenvolvidas resultou citotóxica como vehículo de transfección de hUC-MSCs.[Abstract] Aging consists of a complex process characterized by the accumulation of senescent cells in tissues and organs, causing the deterioration of the functioning of the organism with age. Cellular senescence is a process caused by permanent DNA damage that leads to loss of cell proliferation capacity and is associated with age-related diseases such as osteoarthritis. With this, there is a growing interest in the formulation of senescent cell models in vitro as a means to investigate new therapeutic targets focused on developing more effective treatments for these pathologies. Specifically, mesenchymal stem cell (MSCs) gene therapy has emerged as a promising tool to increase the therapeutic potential of this cell population. In recent years, various vectors have been studied for the transfer of therapeutic genes based on viral and non-viral systems. However, the high cytotoxicity of these vectors added to the high sensitivity of senescent cells limits their use for biomedical research purposes. In order to overcome these limitations, niosomes have been developed, being non-viral self-assembled vectors with promising performance for gene delivery compared to the most widely studied, liposomes. Thus, the aim of the present study was to develop niosome-based gene delivery vehicles in senescent MSCs isolated from the umbilical cord stroma (hUC-MSCs). To this end, a senescence model was developed based on the use of the Cdks4/6 inhibitor drug, Palbociclib, on hUC-MSCs. Two niosome formulations containing 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonio propane (DOTMA) as cationic lipid, cholesterol or squalene as auxiliary lipid, and polysorbate 60 and poloxamer as nonionic surfactants were prepared. The transfection efficiency and cytotoxic profile of the niosomes complexed with the plasmid pGL4.14[luc2/Hygro] containing the luciferase reporter gene was analyzed in hUC-MSCs (senescent and non-senescent) and compared with those obtained with the commercial liposome Lipofectamine. The results obtained showed that the niosome-plasmid complexes (nioplexes) presented appropriate physicochemical features for transfection of senescent and non-senescent hUC-MSCs, with cholesterol nioplexes formed at a DOTMA/pDNA ratio of 5 being the most efficient. In addition, none of the formulations developed were cytotoxic as transfection vehicles for hUC-MSCs.Traballo fin de mestrado (UDC.FCS). Asistencia e investigación sanitaria. Especialidade en Fundamentos de investigación biomédica. Curso 2021/202