Interacción de componentes de la proteína GAG del VIH-1 con modelos de membranas biológicas y su regulación mediada por ácidos nucleicos

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022.El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, epidemia que afecta a la sociedad por hace casi ya medio siglo. El ciclo de vida del VIH puede ser dividido en dos grandes etapas: una etapa de eventos tempranos, caracterizada por el reconocimiento de la célula a infectar (linfocito T CD4+), desensamblado de la partícula viral, transcripción reversa e integración de su genoma en el del huésped; y una etapa de eventos tardíos, caracterizada por la producción de proteínas estructurales, el ensamblado a nivel de membrana de las partículas virales, con su posterior salida de la célula y maduración, generándose nuevos virus listos para infectar otras células. La proteína GAG presenta un rol fundamental en la segunda etapa de este proceso, pues es encargada de coordinar el ensamblado del virus a nivel de la membrana plasmática. Varios miles de moléculas de GAG interaccionan entre sí, con ARN y con la membrana celular para formar partículas virales inmaduras, posteriormente liberadas al medio extracelular. Este paso de asociación a membranas de GAG está dirigido por el dominio matriz (MA), ubicado en su región amino terminal. Dicho dominio se encuentra miristoilado y posee una región altamente básica responsable de la interacción con los lípidos negativos de la membrana, en especial con el fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato (PIP2). Además, MA se une a moléculas de ARN, ligandos que pueden actuar como competidores para la interacción con los lípidos, en un mecanismo que está propuesto como fundamental para regular la especificidad del proceso hacia la membrana celular. Teniendo en cuenta este marco biológico, en esta tesis se estudió, desde un punto de vista fisicoquímico, la interacción de componentes amino terminales de GAG con sistemas modelo de biomembranas, analizando cómo esto podría estar regulado por la presencia de oligonucleótidos. Para ello se utilizaron diversos métodos experimentales, que van desde estudios en interfases de monocapas proteicas y lipídicas hasta el uso de sistemas de bicapas. Se emplearon, como modelos de trabajo, a la proteína MA obtenida de forma recombinante, así como a un péptido formado por los primeros 21 aminoácidos de dicha proteína (MA21). Se estudiaron las propiedades de estas moléculas en solución y en la interfase agua-aire, así como su capacidad de asociarse a los modelos de membranas antes mencionados. Se analizó la importancia del ácido mirístico de la región amino terminal de la proteína, observándose un aumento en la estabilidad de MA, tanto en solución como en la interfase agua-aire. Además, fue posible concluir que dicho grupo modificador es importante en la asociación a interfases neutras y que promueve efectos repulsivos que contrastan con el carácter atractivo de las interacciones laterales entre los lípidos aniónicos y los residuos básicos de MA. Por otra parte, se observó que la unión a ácidos nucleicos reduce la estabilidad superficial e interfiere en las interacciones de MA con interfases lipídicas, tanto en términos de su cinética de adsorción como de las interacciones laterales. Adicionalmente, se aprovecharon las propiedades fluorescentes del péptido MA21 para evaluar su partición a membrana, donde se empleó por primera vez el análisis de fasores espectrales en este tipo de estudios. Se observó que las interacciones electrostáticas juegan un papel importante en esta partición y que la miristoilación reduce la energía libre del proceso. Se analizaron los efectos de la presencia de PIP2 y se observó que la mencionada acción reguladora del ARN se mantiene aún en condiciones experimentales donde la afinidad por membranas no es muy diferente en presencia o ausencia de este lípido. Es por ello que este efecto de “competencia” entre los oligonucleótidos y los liposomas no es explicable solamente en base a una relación de afinidades entre moléculas, como es considerado hasta el momento. En esta misma línea, este fenómeno regulador se observó en sistemas de vesículas lipídicas, pero no en monocapas, sugiriendo que las características fisicoquímicas del entorno lipídico del PIP2 también serían importantes y que la sola presencia de este lípido, visto como molécula aislada, no sería una condición suficiente para esta especificidad de MA con la membrana celular. El contenido principal del presente texto se organiza en un capítulo introductorio, cinco capítulos de resultados experimentales, un epílogo y un apéndice. Posterior a este prefacio se encuentra un glosario de las abreviaturas utilizadas (destacando la página en donde son empleadas por primera vez), seguido de la tabla de contenidos del texto principal. El capítulo introductorio contextualiza, de forma cronológica, el marco teórico que dio a luz al proyecto de investigación del cual surge esta tesis y culmina con el planteamiento de los objetivos propuestos. Los capítulos del 1 al 5 denotan los resultados alcanzados y se organizan en función del tipo de sistema de estudio, que son: estudios en solución (capitulo 1), estudios en sistemas de monocapas (capítulos 2 y 3) y estudios en sistemas de bicapas (capítulos 4 y 5). Al final de estos, se incluye un epílogo que resume de forma conjunta las conclusiones principales alcanzadas; seguido de un apéndice que contiene los detalles sobre las metodologías experimentales y el procesamiento de datos empleado. Al final del documento se resumen las referencias bibliográficas citadas a lo largo del texto, así como el índice de figuras, tablas y apartados. Un último comentario previo a la lectura de esta historia. Si bien las leyendas de cada figura denotan claramente su contenido, con el objetivo de facilitarle al lector una familiarización con los resultados, se empleó un sistema de colores consistente a lo largo de la mayor parte del texto. Para entender dicho sistema, primero es necesario anticipar que en este trabajo se utilizaron principalmente cuatro especies de interés que serán apropiadamente introducidas en el capítulo 1, que son la proteína MA y el péptido MA21 en sus variantes miristoiladas y no miristoiladas. Cuando se haga referencia a estas moléculas de modo general (o de modo específico a la variante no miristoilada) se emplearán los términos “MA” o “MA21”, mientras que cuando se haga referencia de forma específica a sus variantes miristoiladas se utilizarán los términos “myrMA” o “myrMA21”. De esta forma, en la mayoría de las figuras el color rojo hará referencia a resultados relacionados con MA, el color negro con myrMA, el color azul con MA21 y el color verde con myrMA21. Sin nada más que agregar, la escena queda lista para adentrarse en esta obra.2024-06-30Fil: Pérez Socas, Luis Benito. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina