Ascertaining mycobacterial inducible resistance to peptidoglycan synthesis inhibitors

A tuberculose (TB), doença infeciosa causada pelo agente patogénico Mycobacterium tuberculosis (Mtb), é um grave problema de saúde pública e uma significante causa de morte. A situação epidemiológica é agravada pela emergência e propagação de estirpes resistentes, nomeadamente TB multirresistente (MDR-TB) e TB extensivamente resistente (XDR-TB), que reduzem as opções terapêuticas e levam a um maior risco de insucesso do tratamento. Esta situação levou à necessidade de reavaliar opções alternativas ao tratamento padrão, incluindo a potencial adição de β-lactâmicos aos regimes terapêuticos. Os β-lactâmicos são uma eficaz classe de antibióticos, que têm como alvo as transpeptidases envolvidas na síntese do peptidoglicano (PG), um componente da parede celular comum a todas as bactérias. Anteriormente, os β-lactâmicos tinham sido excluídos do tratamento de TB devido à resistência intrínseca de Mtb. Esta é conferida pela presença de uma eficaz β-lactamase, BlaC, e pela peculiar parede celular micobacteriana, com um cross-linking do PG atípico, sintetizado por L,D-transpeptidases, enzimas resistentes à inibição pela maioria dos β-lactâmicos. No entanto, estudos recentes demonstraram que a combinação de um β-lactâmico com um inibidor da β-lactamase, adicionado a um regime de tratamento da TB tem resultados promissores contra estirpes resistentes de Mtb. De modo a otimizar a aplicação dos β-lactâmicos, é importante caracterizar o seu potencial de indução de resistência em micobactérias. Assim, o objetivo desta tese foi explorar o potencial de indução de resistência de inibidores da síntese do PG, nomeadamente β-lactâmicos, em micobactérias, após tratamento com estes fármacos, e caracterizar os isolados obtidos. Para este fim, isolados resistentes da estirpe não-patogénica M. smegmatis (Msm) foram selecionados após tratamento com elevadas concentrações de vários antibióticos. Obtiveram-se trinta e nove isolados: vinte e quatro derivados da estirpe Msm mc2155 (WT), selecionados com amoxicilina, meropenem (com e sem adição de clavulanato), vancomicina, rifampicina, isoniazida e etambutol; três derivados da estirpe Msm PM965, selecionados com meropenem; e doze isolados submetidos a dois tratamentos de seleção, o primeiro com isoniazida ou etambutol, e o segundo com amoxicilina ou meropenem. Para cada tratamento, a frequência de resistência foi determinada, com valores entre 1x10-6 e 1x10-10, sendo os mais elevados observados para a isoniazida, a amoxicilina e o meropenem. A determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMIs) confirmou o fenótipo de resistência para a maioria dos isolados; e evidência de resistência cruzada foi observada para os dois β-lactâmicos, meropenem e amoxicilina, e ainda para outros três antibióticos pertencentes a classes distintas, amoxicilina, vancomicina e isoniazida. Os isolados selecionados com um β-lactâmico foram ainda caracterizados através da realização de ensaios de hidrólise da nitrocefina e de efluxo de brometo de etídio. Diferenças entre os isolados selecionados com os dois β-lactâmicos (meropenem e amoxicilina), observadas neste ensaio, sugerem a ação de diferentes mecanismos de resistência, embora, em ambos os casos, ter sido registado um aumento da CMI da amoxicilina. Poucas diferenças entre isolados e estirpes parentais foram observadas nos ensaios de efluxo, com a exceção de dois isolados selecionados com amoxicilina e um selecionado com amoxicilina e clavulanato que sofreram uma inesperada diminuição da capacidade de efluxo. A análise genómica revelou que os isolados selecionados com um fármaco anti-TB desenvolveram mutações nos genes que codificam o alvo destes antibióticos, confirmando assim que o método de seleção utilizado neste trabalho foi bem-sucedido e as conclusões que permitiu obter podem ser associadas ao organismo patogénico Mtb. As mutações identificadas nos isolados selecionados com amoxicilina ou vancomicina localizam-se em genes reguladores, que apesar de não serem diretamente afetados pelo antibiótico podem regular a expressão de genes associados aos alvos destes fármacos. Estes resultados confirmam o desenvolvimento de resistência induzida a inibidores da síntese do PG, assim como o envolvimento de diferentes mecanismos de resistência. A análise genómica de vários isolados está ainda a decorrer e juntamente com uma análise de RNA-sequencing, irá, no futuro, fornecer mais esclarecimentos em relação aos mecanismos envolvidos na resistência aos antibióticos.Tuberculosis (TB), caused by the pathogenic organism Mycobacterium tuberculosis (Mtb), is a major public health problem and a leading cause of death. The epidemiologic situation is aggravated by the emergence and spreading of resistant strains, namely multidrug-resistant TB (MDR-TB) and extensively drug-resistant TB (XDR-TB), which reduce the treatment options and result in a higher risk of therapy failure. This led to the necessity of revaluating alternative options for the standard treatment of TB, including the potential addition of β-lactams to therapy regimens. β-lactams are a highly successful class of antibiotics which target the transpeptidases involved in the biosynthesis of the peptidoglycan (PG), a cell wall (CW) component common to all bacteria. β-lactams were previously excluded from TB therapy due to the intrinsic resistance of Mtb to this antibiotic class, conferred by the presence of a highly effective β-lactamase, BlaC, and the unusual mycobacterial CW, with a PG cross-linking performed by L,D-transpeptidases resistant to inhibition by most β-lactams. However, recent studies showed that the combination of a β-lactam with a β-lactamase inhibitor added to an anti-TB treatment regimen has promising results against drug-resistant Mtb strains. To ensure the optimized application of β-lactams it is important to characterize their resistance-inducing potential in mycobacteria. Thus, the aim of this thesis was to explore the induction of resistance to PG synthesis inhibitors, namely β-lactams, in mycobacteria, upon exposure to these antibiotics, and to characterize the obtained isolates. To do this, resistant isolates of the non-pathogenic organism M. smegmatis (Msm) were selected by exposure to high concentrations of several antibiotics. Thirty-nine isolates were obtained: twenty-four Msm mc2155 (WT)-derivatives selected with amoxicillin and meropenem, in the presence and absence of clavulanate, vancomycin, rifampicin, isoniazid and ethambutol; three Msm PM965-derivatives, selected with meropenem; and twelve isolates subjected to two different selections, the first with isoniazid or ethambutol, and the second with amoxicillin or meropenem. Resistance frequency was determined for each treatment, with values ranging from 1x10-6 to 1x10-9, with the highest frequencies registered for isoniazid, amoxicillin and meropenem. Furthermore, minimal inhibitory concentration (MIC) assays confirmed the resistance phenotype for most of the isolates; evidence of cross-resistance was also noticeable between the two β-lactams, meropenem and amoxicillin; and three antibiotics of different classes amoxicillin, vancomycin, and isoniazid. To further characterize the isolates selected with a β-lactam antibiotic, nitrocefin hydrolysis and ethidium bromide efflux assays were performed. The difference in nitrocefin hydrolysis values between meropenem and amoxicillin-selected isolates suggests different mechanisms of resistance are at play despite the increase in amoxicillin MIC observed in both cases. Regarding the efflux quantification, few variations were observed between isolates and parental strains, with the exceptions of two amoxicillin and one amoxicillin/clavulanate isolates which presented an unexpected decrease in efflux capacity. Furthermore, whole genomic analysis of the isolates selected with the anti-TB antibiotics revealed mutations in the expected drug target genes, confirming that the method used in this work to obtain resistant isolates was successful and the conclusions taken from it can be associated with Mtb. Mutations in amoxicillin and vancomycin-selected isolates were identified on regulatory genes, which albeit not directly targeted by the antibiotics might regulate the expression of genes associated with the drug targets. These findings confirm the development of inducible resistance to PG synthesis inhibitors and the involvement of different resistance mechanisms; the genomic analysis of the remaining resistant isolates is still in progress and will in the future, together with an RNA-sequencing analysis, provide more insight into the pathways involved in the development of drug resistance