Deteção molecular de agentes transmitidos por ixodídeos em bovinos da raça mertolenga em Portugal e mutações no gene cytb de Theileria annulata associadas a resistência a Buparvaquona

As doenças transmitidas por ixodídeos afetam 80% da população bovina mundial, possuindo um grande impacto na produção pecuária e considerável prejuízo económico em todo o mundo. Espécies de Theileria, Babesia e Anaplasma são agentes transmitidos por ixodídeos, com ampla distribuição particularmente nas regiões tropicais e subtropicais. A raça bovina Mertolenga ocorre em diversas regiões de Portugal em mais de 700 explorações, sendo a sua maioria na região sul, como a região do Alentejo. O Alentejo constitui a zona de maior produção bovina em Portugal Continental com aproximadamente 48% (810 000/1 691 000) da produção nacional. O primeiro objetivo deste estudo foi determinar a prevalência na região do Alentejo em Portugal dos hemoparasitas Babesia bigemina, Theileria orientalis e Theileria annulata e da bactéria Anaplasma marginale, em um total de 423 amostras de bovinos Mertolengos. Para tal, procedeu-se a deteção dos genes ama1, mpsp, tams1 e msp1b, respetivamente, por técnica de diagnóstico molecular PCR. A prevalência global foi de 48,70% (206/423; IC95% 43,97-53,45) com Anaplasma marginale sendo o mais abundante dos agentes com 30,3% (128/423; IC95% 26,1-34,8) e Theileria annulata o mais abundante dos agentes do filo Apicomplexa com 14,4% (61/423; IC95% 11,4-18,1) seguido de Babesia bigemina 13,9% (59/423; IC95% 11,0-17,6). Theileria orientalis surge como o hemoparasita com menor prevalência, com apenas 6,4% (27/423; IC95% 4,4-9,1). Ainda, das 206 amostras positivas 151 (73,30%) apresentaram infeções únicas, 42 (20,39%) infeções duplas e 13 (6,31%) infeções triplas. Este trabalho contribuiu para aumentar a informação disponível sobre a prevalência dos agentes patogénicos Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Theileria orientalis e Theileria annulata no território nacional e é pioneiro pelo facto de ser o primeiro a ser realizado em bovinos da raça Mertolenga. Na ausência de alternativas às naftoquinonas, o surgimento de estirpes resistentes representa um perigo significativo para a pecuária em países endémicos com Theileriose Tropical. O surgimento da resistência ao fármaco theilericida amplamente utilizado, a buparvaquona, continua a limitar a eficácia da terapia contra o parasita Theileria annulata. Mutações no gene cytb de Theileria annulata têm sido associadas a esta resistência. Perante tal situação, o segundo objetivo deste estudo consistiu em identificar em 13 amostras positivas para Theileria annulata, provenientes de diferentes explorações do objetivo anterior, mutações que possam estar envolvidas na resistência ao fármaco buparvaquona. O gene cytb foi amplificado por nested-PCR e posteriormente sequenciado e comparado com a estirpe de referência Ankara. O alinhamento das sequências nucleotídicas revelou a presença de mutações específicas nos isolados deste estudo, já descritas por outros autores em estudos anteriores em 9 posições, sendo 4 mutações não sinónimas. Para além disso, 35 novos polimorfismos ainda não descritos na literatura foram encontrados com 15 mutações não sinónimas resultando em alterações aminoacídicas. Os dados obtidos neste estudo sugerem evidências da existência de novas mutações pontuais no gene cytb de Theileria annulata que podem estar associadas à resistência ao tratamento com buparvaquonaTick-borne diseases affect 80% of the world´s bovine population, having a significant impact on livestock production and causing considerable economic damage worldwide. Theileria, Babesia, and Anaplasma species are tick-borne pathogens widely distributed, particularly in tropical and subtropical regions. The bovine breed Mertolenga lives in several regions of Portugal in more than 700 farms, the majority of which in the southern region, such as the Alentejo region. The Alentejo is the area with the largest bovine production in mainland Portugal with approximately 48% (810 000/1 691 000) of the national production. The first goal of this study was to determine the prevalence in the Alentejo region of the tick-borne pathogens Babesia bigemina, Theileria orientalis, Theileria annulata, and Anaplasma marginale, in a total of 423 samples of the Mertolenga breed. To achieve this, we proceeded to detect the genes ama1, mpsp, tams1, and msp1b, respectively, by using PCR-based methodology. The overall prevalence was 48.7% (206/423; CI 95% 43.97-53.45) with Anaplasma marginale being the most abundant of the agents with a prevalence of 30.3% (128/423; CI 95% 26.1-34.8) and Theileria annulata being the most abundant agent of the Apicomplexa phylum with 14.4% (61/423; CI 95% 11.4-18.1), followed by Babesia bigemina with 13.9% (59/423; CI 95% 11.0-17.6). Theileria orientalis was the haemoparasite with the lowest prevalence, with only 6.4% (27/423; CI 95% 4.4-9.1). Also, of the 206 positive samples, 151 (73.30%) corresponded to single infections, 42 (20.39%) corresponded to double infections, and 13 (6.31%) corresponded to triple infections. This work contributes to increasing the available information on the prevalence of the tick-borne pathogens Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Theileria orientalis and Theileria annulata in the Portuguese territory and is the pioneer in the fact that it is the first study of this type to be carried out in the Mertolenga breed. In the absence of alternatives to naphthoquinones, the emergence of resistant strains poses a significant danger to livestock in tropical theileriosis endemic countries. The emergence of resistance to the widely used theilericide drug buparvaquone continues to limit the effectiveness of therapy against the Theileria annulata parasite. Mutations in the cytb gene of Theileria annulata have been associated with such resistance. The second goal of this study consisted in the identification of mutations that may be involved in resistance to buparvaquone treatment by analyzing 13 Theileria annulata positive samples from different farms identified in the first part of this study. The cytb gene was amplified by nested-PCR, sequenced, and compared with the Ankara reference strain. The alignment of the nucleotide sequences revealed the presence of 9 specific mutations that had already been described in other studies, with 4 of them corresponding to non-synonymous mutations. Interestingly, alignment of the sequences of our isolates revealed 35 novel mutations in the cytb gene not yet described in the literature, with 15 of them corresponding to non-synonymous mutations. Our results indicate the existence of novel point mutations in the cytb gene of Theileria annulata that may be associated with the resistance to buparvaquone treatments