Nova Metodologia para o Diagnóstico e Monitorização do Adenocarcinoma Ductal Pancreático

O cancro pancreático destaca-se como o cancro com a menor taxa de sobrevivência na Europa, sendo que o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) constitui 95% dos casos. O prognóstico de PDAC depende fortemente de plano de rastreio pois os sintomas são negligenciáveis nos estadios ini-ciais da doença, o que leva a que aquando do diagnóstico 80% dos tumores sejam localmente avançados ou metastáticos. A recorrência do cancro em 80% dos doentes após ressecção cirúrgica contribui igual-mente para a reduzida taxa de sobrevivência. Para melhorar o prognóstico do PDAC é fundamental identificar biomarcadores para diagnóstico e monitorização da doença, concomitantemente ao desenvolvimento de metodologias para a sua carac-terização. A utilização de biópsias líquidas, particularmente a análise de DNA tumoral circulante (ctDNA), destaca-se como uma abordagem pouco invasiva de análise de biomarcadores libertados pela massa tumoral e suas metástases. De referir que mutações no gene KRAS são detetadas em mais de 90% dos doentes, tornando-se num potencial biomarcador de PDAC. A análise mutacional de KRAS em amostras de tecido tumoral e ctDNA demonstrou potencial no âmbito do diagnóstico diferencial de PDAC, permitindo a identificação de doentes com maior risco de recorrência. Neste projeto, foi desenvolvida e otimizada uma metodologia de Amplification Refractory Mu-tation System (ARMS) acoplada a High Resolution Melting Analysis (HRMA) para deteção das duas mutações de KRAS mais frequentes em PDAC. Após otimização em material genómico controlo, a estratégia foi validada com amostras tumorais e de plasma de doentes com PDAC, e os resultados com-parados aos obtidos por Sequenciação de Sanger (SS), o método de referência para análise mutacional. A estratégia ARMS/HRMA desenvolvida destaca-se por menor tempo de resposta comparativa-mente a SS, tendo revelado sensibilidade e especificidade para a deteção de ambas as mutações em amostras tumorais. A deteção de mutações em ctDNA extraído de plasma não demonstrou a mesma sensibilidade.Pancreatic cancer stands out as the cancer with the lowest survival rate in Europe, with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) accounting for 95% of cases. The absence of screening tests and symp-toms in the initial stages of the disease means that at the time of diagnosis of PDAC 80% of tumors are locally advanced or metastatic, which contributes to the reduced survival rate. Furthermore, the survival rate is also impacted by the recurrence of cancer, which occurs in 80% of patients after resection surgery with curative intent. The identification of biomarkers and development of new methodologies for their analysis is essential to change the prognosis associated with PDAC. In this context, liquid biopsies, particularly the analysis of circulating tumor DNA (ctDNA), are emerging as an interesting tool in the diagnosis and monitoring of PDAC. Mutations in KRAS are detected in more than 90% of patients, so KRAS stands out as a potential biomarker of PDAC. Mutational analysis of KRAS in tumor tissue and ctDNA samples may contribute to improve the diagnosis of PDAC and support the identification of patients at higher risk of recurrence. In this project, an Amplification Refractory Mutation System (ARMS) methodology coupled with High Resolution Melting Analysis (HRMA) was developed for detection of the two most prevalent KRAS mutations in PDAC. After reaction optimization with cell lines, the methodology was validated using tumor and plasma samples from patients with PDAC, and the results compared to those obtained by Sanger Sequencing (SS), the gold-standard method for mutational analysis. The developed ARMS/HRMA, which stands out for its reduced response time compared to SS, demonstrated sensitivity and specificity for the detection of both mutations in tumor samples, however, the same was not verified regarding its detection in ctDNA extracted from plasma