Study of the response of acute myeloid leukemia cells to the inhibitor of the BCL-2 protein in a 2D and 3D in vitro culture model.

Pomimo intensywnego rozwoju nauki w ostatnich latach, terapia ostrej białaczki szpikowej (AML) to wciąż ogromne wyzwanie dla współczesnej medycyny. Obecnie wiele uwagi poświęca się antyapoptotycznym białkom z rodziny Bcl-2, które są uważane za kluczowy element odpowiadający za oporność komórek nowotworowych na stosowane terapie. Jednym z nich jest antyapoptotyczne białko Bcl-2, ulegające nadekspresji w wielu typach nowotworów, w tym w AML. Opracowanie ABT-199 (wenetoklaks), selektywnego inhibitora tego białka, przyniosło ogromne nadzieje w walce z chorobą. Głównym celem niniejszej pracy była zatem ocena aktywności cytotoksycznej ABT-199 wobec komórek ostrej białaczki szpikowej. W badaniach wykorzystano linie komórkowe 5 różnych podtypów AML: KG-1, HL-60, NB-4, ML-1 oraz MV4-11. Komórki białaczkowe eksponowano na działanie inhibitora ABT-199 w wybranych stężeniach. Podstawowy poziom ekspresji białka Bcl-2 w komórkach oznaczono przy użyciu metody Western Blot. Ocenę wpływu ABT-199 na żywotność komórek przeprowadzono z użyciem testu Presto Blue. Zmiany w liczbie komórek apoptotycznych określono za pomocą testu z aneksyną V i jodkiem propidyny. W pracy dokonano również oceny aktywności przeciwbiałaczkowej wenetoklaksu w zależności od typu hodowli. W modelu hodowli 2D oraz 3D na dwóch liniach komórkowych, HL-60 i MV4-11, porównano wpływ ABT-199 na żywotność oraz morfologie komórek pod kątem indukowania w nich procesu apoptozy. Ocenę żywotności przeprowadzono z wykorzystaniem testu PrestoBlue, z kolei zmiany w morfologii oceniono z wykorzystaniem mikroskopu świetlnego. Wyniki otrzymane w niniejszej pracy wskazują, że ABT-199 powoduje spadek żywotności komórek oraz wzrost liczby komórek apoptotycznych w każdej z badanych linii AML. Efekt cytotoksyczny wenetoklaksu był najsilniejszy w komórkach MV4-11, a najmniej wrażliwe okazały się być komórki linii ML-1. Wyniki eksperymentów prowadzonych w hodowli 3D wykazały podobny trend spadku żywotności oraz wzrost liczby komórek apoptotycznych. Jednak, co warto podkreślić, zmiany te były dużo mniej wyraźne w hodowli 3D w porównaniu do hodowli 2D, co wskazuje na dużo wyższą oporność komórek hodowanych w warunkach 3D na testowany inhibitor. Wyniki uzyskane w niniejszej pracy potwierdzają wysoką aktywność przeciwbiałaczkową wenetoklaksu, która jest uzależniona od rodzaju linii komórkowej, a także od typu hodowli. Co ważne, uzyskane wyniki przedstawiają hodowle 3D jako zdecydowanie lepiej odzwierciedlający warunki iv vivo model do badań prowadzonych w warunkach in vitro.Despite the intensive development of science in recent years, the therapy of acute myeloid leukemia (AML) is still a huge challenge for modern medicine. Currently, much attention is focused on the anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family, which are considered to be the key element responsible for the resistance of cancer cells to the applied therapies. One of them is the anti-apoptotic Bcl-2 protein, overexpressed in many types of cancer, including AML. The development of ABT-199 (venetoclax), a selective inhibitor of this protein, has brought great hopes in the fight against the disease. Therefore, the main aim of this study was to evaluate the cytotoxic activity of ABT-199 against acute myeloid leukemia cells. Cell lines of 5 different AML subtypes: KG-1, HL-60, NB-4, ML-1 and MV4-11 were used in the study. Leukemic cells were exposed to ABT-199 at selected concentrations. Basal Bcl-2 protein level in cells was determined using the Western Blot technique. Evaluation of the effect of ABT-199 on cell viability was performed using the Presto Blue test. Changes in the number of apoptotic cells were determined using the Annexin V and propidium iodide assay. The antileukemic activity of venetoclax depending on the type of cell culture was also assessed. In the 2D and 3D cell culture model of two AML cell lines, HL-60 and MV4-11, the effect of ABT-199 on the viability and morphology of cells was compared in terms of inducing the process of apoptosis in them. The viability was assessed using the PrestoBlue test, while the changes in morphology were assessed using a light microscope. The obtained results showed that ABT-199 caused a decrease in cell viability and an increase in the number of apoptotic cells in each of the tested lines. The cytotoxic effects of venetoclax were strongest in MV4-11 cells, and ML-1 cells proved to be the least sensitive. The results of experiments conducted in 3D cell culture showed a similar trend of decrease in viability and an increase in the number of apoptotic cells. However, it is worth emphasizing that these changes were much less pronounced in 3D versus 2D cell culture, which indicates a much higher resistance of cells grown under 3D conditions to the tested inhibitor. The results obtained in this study confirm the high anti-leukemic activity of venetoclax, which depends on the type of cell line and the type of cell culture. Importantly, the obtained results show 3D cell culture as a model for in vitro studies that much better reflects the in vivo conditions