Research on humoral factors of the immune system of Eisenia andrei earthworms.

Dżdżownice (Lumbricidae) to rodzina należąca do skąposzczetów glebowych zasiedlających różnorodne typy gleb. Najczęściej są to siedliska wilgotne, żyzne i bogate w szczątki organiczne. Układ odpornościowy tych zwierząt, dostosowując się do funkcjonowania w zróżnicowanych środowiskach, na przestrzeni lat ewoluował tak, aby wykształcić mechanizmy obronne przeciwko szerokiej gamie patogenów. Organizm dżdżownic, podobnie jak innych bezkręgowców, bazuje na wrodzonym układzie odpornościowym, w którym działają zarówno mechanizmy oparte na odpowiedzi komórkowej (celomocyty), jak i humoralnej. W niniejszej pracy podstawę badań stanowiły czynniki humoralne, tj. celomatyczny czynnik cytolityczny (CCF-1, CCF, ang. coelomic cytolytic factor), białko LBP/BPI (ang. lipopolysaccharide binding protein, LBP oraz ang. bactericidal/permeability-increasing protein, BPI). oraz lizozym. Z czego CCF odpowiedzialny jest za rozpoznanie patogenów oraz aktywację kaskady profenoloksydazy, LBP/BPI mając zdolność wiązania lipopolisacharydu (LPS) pełni funkcje przeciwbakteryjne, a lizozym bierze udział w mechanizmach obronnych przeciwko bakteriom Gram-dodatnim. Celem badań było sprawdzenie wpływu stymulacji in vivo lipopolisacharydem (pochodzenia bakteryjnego) oraz zymosanem (pochodzenia grzybowego) na ekspresję genów kodujących CCF, LBP/BPI oraz lizozym w celomocytach dżdżownic Eisenia andrei. Zmiany ekspresji badano w celomocytach pozyskanych w trzech punktach czasowych, po 6, 24 i 72 godzinach od stymulacji. Dodatkowym celem pracy była normalizacja metodyki, skupiono się na procedurze izolacji RNA dostosowując odpowiednią metodę do specyfiki badanego materiału. Porównywano izolację RNA metodą chloroformową z metodą kolumnową. Wykazano, iż lipopolisacharyd zwiększa ekspresję genu kodującego celomatyczny czynnik cytolityczny oraz genu kodującego białko LBP/BPI jednocześnie nie wpływając na ekspresję genu kodującego lizozym. Podobnie stymulacja zymosanem zwiększyła ekspresję ccf oraz lbp/bpi nie zmieniając poziomu ekspresji lizozymu. Podsumowując, obserwując aktywację odpowiedzi humoralnej wrodzonego układu odpornościowego pod wpływem LPS oraz zymosanu można stwierdzić, iż dżdżownice posiadają szerokie spektrum mechanizmów obronnych zwalczających patogeny różnorodnego pochodzenia.Earthworms (Lumbricidae) are members of soil oligochaetes that inhabit various types of soil. They are most abundant in moist, fertile and rich in organic matter habitats. Due to the specific habitat conditions in which they live, their immune system adapted to functioning in a variety of environments by developing defense mechanisms against a wide range of pathogens. As invertebrates, earthworms are able to protect themselves against invading pathogens due to efficient innate immune system associated with cellular (coelomocytes) and humoral defense mechanisms. In this work I focused on the selected humoral factors, such as i.e. coelomic cytolytic factor (CCF-1, CCF), LBP/BPI (lipopolysaccharide binding protein, LBP and bactericidal/permeability-increasing protein, BPI) and lysozyme. Of which CCF is responsible for the recognition of pathogens and activation of the profenoloxidase cascade, LBP/BPI having the ability to bind lipopolysaccharide (LPS) and performs antibacterial functions whereas lysozyme is involved in defense mechanisms against Gram-positive bacteria. The aim of the study was to test the effect of in vivo stimulation with lipopolysaccharide (bacterial origin) and zymosan (fungal origin) on the expression of ccf, lbp/bpi and lysozyme in Eisenia andrei coelomocytes. Changes in gene expression were examined in coelomocytes and obtained at three time points 6, 24 and 72 hours after stimulation.First, the methodology was standardized. The focus was on adjusting the appropriate method of RNA isolation to the specificity of the tested material. RNA extraction with chloroform-based method was compared to the use of column-based method. It has been shown that lipopolysaccharide upregulates the expression of the gene encoding the coelomatic cytolytic factor and the gene encoding the LBP/BPI protein without affecting the expression of the gene encoding lysozyme. Similarly, stimulation with zymosan increased the expression of ccf and lbp/bpi without changing the level of lysozyme expression. In summmary, based on the observation of the activation of the humoral defense mechanisms under the influence of LPS and zymosan stimulation, it can be concluded that earthworms have a wide range of mechanisms protecting them from pathogens of various origins