Production and purification of Arabidopsis thaliana recombinant CDKD;2 and cyclin H using the Escherichia coli prokaryotic expression system

Przebieg cyklu komórkowego u poszczególnych grup organizmów eukariotycznych regulowany jest przez konserwatywną grupę kinaz białkowych zależnych od cyklin (CDK). U roślin wyróżnia się 7 głównych klas CDK (A-G), spośród których dwie grupy białek - CDKD oraz CDKF przynależą równocześnie do grupy kinaz aktywujących CDK (CAK). U Arabidopsis thaliana zidentyfikowano trzy białka CDKD (At;CDKD;1-3). Aktywacja białka At;CDKD;2 oprócz fosforylacji konserwatywnych reszt aminokwasowych przez białko CDKF;1 wymaga również utworzenia kompleksu z cykliną H. Celem niniejszej pracy magisterskiej było skonstruowanie wektorów ekspresyjnych kodujących warianty pożądanych białek (At;CDKD;2 oraz At;CycH;1) z zastosowaniem systemu klonowania Gateway. Następnie uzyskanymi plazmidami pDEST17 zawierającymi wstawki kodujące pożądane białka rekombinowane transformowano komórki kompetentne wybranych szczepów bakteryjnych E. coli, w których produkowano białka At;CDKD;2 lub At;CycH;1 z metką histydynową. W pracy podjęto próbę uzyskania rozpuszczalnych form analizowanych wariantów białek At;CDKD;2 oraz At;CycH;1 z zastosowaniem różnych układów doświadczalnych, m.in. przeprowadzając koekspresję z białkami opiekuńczymi w celu zminimalizowania zjawiska agregacji analizowanych białek w postaci ciał inkluzyjnych. W wyniku przeprowadzonych badań uzyskano rozpuszczalną formę białka At;CycH;1 o długości 299 aminokwasów.Cell cycle progression in different groups of eukaryotic organisms is regulated by a conservative group of cyclin dependent kinases (CDK). In plants there are 7 main classes of CDK (A-G), among which two groups of proteins - CDKD and CDKF belong to the group of CDK activating kinases (CAK). Three CDKD proteins have been identified in Arabidopsis thaliana (At;CDKD;1-3). Activation of the At;CDKD;2 protein requires phosphorylation of conserved amino acid residues by the CDKF;1 kinase and formation of a complex with cyclin H. The aim of this thesis was to construct expression vectors encoding variants of the desired proteins (At;CDKD;2 and At;CycH;1) using the Gateway cloning system. Subsequently, the obtained pDEST17 plasmids with inserts encoding the desired proteins were transformed into competent cells of selected E. coli bacterial strains, in which At;CDKD;2 or At;CycH;1 proteins with a histidyl tag were produced. The study attempts to obtain soluble forms of the analyzed proteins At;CDKD;2 and At;CycH;1 using various experimental systems, including coexpression with chaperones in order to minimize aggregation of the analyzed proteins in inclusion bodies. As a result of the research, a soluble form of the protein At;CycH;1 with a length of 299 amino acids was obtained