Role of the Arabidopsis thaliana AT4G25290 gene in response to cold stress and light-regulated expression of the chloroplast transcripts

Gen AT4G25290 rośliny modelowej Arabidopsis thaliana koduje białko przyporządkowane do nadrodziny kryptochromów i fotoliaz. Żadna z postulowanych funkcji tego białka nie jest obecnie potwierdzona. Białko AT4G25290 zlokalizowano w chloroplastach (dane nieopublikowane), gdzie może potencjalnie oddziaływać z nukleoidem chloroplastu i wpływać na regulację transkrypcji genów chloroplastowych, a także uczestniczyć w przekazie sygnału z chloroplastu do jądra. W sekwencjach otaczających gen AT4G25290 zidentyfikowano potencjalne miejsca wiązania dla czynników transkrypcyjnych, których aktywność jest regulowana przez stres niskiej temperatury. Może to sugerować zaangażowanie produktu genu AT4G25290 w odpowiedź rośliny na warunki stresowe m.in. niską temperaturę. Pierwszym celem pracy było zbadanie wpływu światła czerwonego i niebieskiego na poziomy mRNA wybranych genów w A. thaliana: AT4G25290, a także genów chloroplastowych: PSBD, ATPS oraz RPS18, ulegających transkrypcji z udziałem określonych polimeraz chloroplastowych. Zmierzono też poziomy mRNA genów jądrowych kodujących oksydoreduktazy protochlorofilidu: PORA, PORB, PORC. Następnie skupiono się na analizie wpływu warunków stresowych w postaci niskiej temperatury i ciemności oraz niskiej temperatury i światła na rośliny. Zmierzono poziomy mRNA genów: AT4G25290, COR47 oraz CHS w roślinach. Dokonano także obserwacji morfologii roślin oraz zmierzono zawartość antocyjanów w świeżej masie roślinnej. W eksperymentach wykorzystywano rośliny typu dzikiego oraz mutanty insercyjne typu knock-out at4g25290. Pomiarów poziomu mRNA genów dokonano z użyciem techniki RT-qPCR, zawartość antocyjanów w świeżej masie roślinnej zmierzono przy wykorzystaniu technik spektrofotometrycznych. Otrzymane wyniki pozwalają na potwierdzenie, iż poziom mRNA genu AT4G25290 jest w określony sposób regulowany przez światło niebieskie. Obserwacje poczynione dla genów PORA, PORB oraz PORC pozwalają na potwierdzenie, iż poziomy transkryptów tych genów są w odmienny sposób regulowane przez określone warunki świetlne, a także na postulowanie, iż w regulację poziomu mRNA PORA może być zaangażowane białko AT4G25290. Poczynione obserwacje nie pozwalają na potwierdzenie istnienia wpływu AT4G25290 na regulację transkrypcji genów chloroplastowych – dla potwierdzenia obserwowanych wyników konieczne są dalsze analizy. Wyniki dotyczące obserwacji wpływu niskiej temperatury pozwalają na wysunięcie postulatu, iż białko AT4G25290 mogłoby być zaangażowane w regulację odpowiedzi na ten czynnik stresowy, jednakże w celu definitywnego potwierdzenia postulowanych zależności należałoby wykonać dodatkowe eksperymenty. Wnioski prezentowane w pracy stanowią podłoże do planowania dalszych eksperymentów.The AT4G25290 gene of the model plant Arabidopsis thaliana encodes a protein assigned to the Cryptochrome/Photolyase Family. Currently, none of the postulated functions of the AT4G25290 has been confirmed. The AT4G25290 protein has been located in chloroplasts (unpublished data), where potentially interacts with the chloroplast nucleoid and influences the regulation of chloroplast gene transcription as well as participates in the signal transmission from the chloroplast to the nucleus. In the sequences surrounding the AT4G25290 gene, potential binding sites for transcription factors, whose activity is regulated by low-temperature stress, have been identified. This may suggest the involvement of the AT4G25290 gene product in the plants’ response to stressful conditions e.g. low temperature. The first aim of the study was to investigate the effect of red and blue light on the mRNA levels of selected genes in A. thaliana: AT4G25290, as well as chloroplast genes: PSBD, ATPS and RPS18, transcribed by specific chloroplast polymerases. The mRNA levels of nuclear genes encoding protochlorophyllide oxidoreductases: PORA, PORB, PORC were also measured. Next, work was focused on analyzing the effect of low temperature stress conditions on plants growing in dark and light conditions. During the experiment mRNA levels for genes: AT4G25290, COR47 and CHS were measured. Plant morfology was observed and the anthocyanin content in fresh weight was measured. Wild type plants and at4g25290 insertional knock-out mutants were used in the experiments. The mRNA levels of genes were measured using the RT-qPCR technique, spectrophotometric techniques were used to measure the content of anthocyanins. Obtained results allow to confirm that the mRNA level of the AT4G25290 gene is regulated in a specific way by blue light. The observations made for the PORA, PORB and PORC genes suggest that the transcript levels of these genes are differently regulated by specific light conditions; they also allow to postulate that the AT4G25290 protein is involved in the regulation of the PORA transcript levels. Performed observations do not allow to determine the effect of AT4G25290 on the regulation of transcription in chloroplasts - further analysis is necessary in addition to obtained results. The results concerning the influence of low temperature support the postulate that the AT4G25290 protein could be involved in the regulation of the response to this stress factor, however, in order to definitively confirm mentioned postulate, additional experiments should be performed. The conclusions presented in the thesis are the basis for designing future experiments