The role of medial entorhinal cortex layer three pyramidal cells in slow oscillations and spatial coding

In the decades since the first studies of amnesia in patient H.M., and subsequent discoveries of functional cell types linked to navigation, the hippocampus (HC) and medial entorhinal cortex (MEC) have been at the center of research on learning and memory. Activity of these structures is coordinated via neuronal oscillations, synchronizing the network at various frequencies including slow oscillations (< 1 Hz), theta (6 -11 Hz), gamma (40 -100 Hz) and ripple (140 – 200 Hz) oscillations. Layer 3 pyramidal cells (L3PCs) of the MEC send projections to area CA1 of the hippocampus, and are thought to be important for HC-MEC communication. I sought to understand the role of L3PCs of the MEC in two types of network activity. First, using optogenetic tools, I silenced L3PCs in an anaesthetized model of slow oscillations in the MEC. Rhythmic Up States (US) could be recorded in vivo, and demonstrated stable frequency and duration over time. Using L3PC-specific expression of archaeorhodopsin in an Oxr1 x Ai40D crossed line, I found that pulsed LED stimulation decreased the frequency of US. These results were mirrored at a lesser magnitude using a closed-loop stimulation system. Further experiments with this paradigm, including with the L2 stellate cell (L2SC)-specific Uchl1-Cre line suggest that L3PCs control the incidence of US in the MEC in a layer- and cell-type specific manner. In a second group of experiments, I studied the effects of L3PC silencing on spatial coding of pyramidal cells (PCs) in CA1, with a focus on theta phase precession (PP). To do so, I employed chronic silicon probe implants with a chemogenetic strategy (hM4D) targeting L3PC cells of freely-moving Oxr1-Cre mice. This led to the abolition of synaptic transmission in vitro, and modest increase of CA1 PC firing rate in vivo after systemic injection of hM4D clozapine-n-oxide (CNO). I determined that treatment with CNO in vivo did not have an effect on PP slopes, correlations, offsets or phase range as measured in a single-trial analysis. The presence of place cells, as well as their spatial properties, were also not altered by CNO treatment. These findings demonstrate that L3PCs in the MEC are an important organizer of rhythmic activity during slow oscillations, but that they are not critical for PP and other spatial coding in CA1. This work may help draw a link between cell and layer-specific pathology in several conditions, as well as informing mechanistic explanations of cognitive symptoms.Seit den ersten Studien zu Amnesie am Patienten H.M. und den anschließenden Entdeckungen von funktionellen Zelltypen, die mit der Navigation verbunden sind, stehen der Hippocampus (HC) und der mediale entorhinale Kortex (MEC) im Mittelpunkt der Forschung zu Lernen und Gedächtnis. Die Aktivität dieser Gehirnstrukturen wird über neuronale Oszillationen koordiniert, die das Netzwerk in verschiedenen Frequenzen synchronisieren: unter anderem langsame- (Slow Oscillation < 1 Hz), Theta- (6 -11 Hz) Gamma- (40 – 100 Hz) und Ripple- (120 – 200 Hz) Oszillationen. Eine wichtige Rolle spielen hierbei Pyramidenzellen aus der dritten Zellschicht (L3PCs) des MEC, die in Area CA1 des Hippocampus projizieren. Dementsprechend lässt sich eine wichtige Rolle dieser Zellen für die Kommunikation zwischen dem HC und dem MEC vermuten. Diese Arbeit untersucht die Rolle der L3PCs des MEC bei zwei Formen neuronaler Aktivität. Hierbei schaltete ich mit optogenetischen Werkzeugen L3PCs in einem anästhesierten Modell für Slow Oscillations im MEC aus. Synchronisierte, rhythmische Aktivitäten (‚Up States‘ (US)) wurden in vivo mit elektrophysiologischen Meßmethoden reliabel erfasst. Unter Verwendung von L3PC-spezifischer Expression von Archaeorhodopsin (Oxr1 x Ai40D), einem Konstrukt, welches lichtabhängig die zelluläre Aktivität inhibiert, konnte ich feststellen, dass gepulste LED-Stimulation die Häufigkeit von US verringert. Diese Ergebnisse spiegelten sich in geringerem Ausmaß bei Verwendung eines Stimulationssystems mit geschlossenem Regelkreis wider. Weitere Experimente, unter anderem mit der Schicht-2-Sternzellen (L2SC)-spezifischen Uchl1-Cre-Linie, legen nahe, dass L3PCs das Auftreten von US im MEC schicht- und zelltypspezifisch steuern. In einer zweiten Gruppe von Experimenten untersuchte ich die Auswirkungen von L3PC-Inhibition auf die räumliche Kodierung von Pyramidenzellen (PCs) in CA1, mit einem Fokus auf die Theta-Phasenpräzession (PP). Dazu wurden chronische Silizium-Sondenimplantate mit einer chemogenetischen Strategie (hM4D), die auf L3PC-Zellen von freibewegenden Oxr1-Cre-Mäusen abzielte, verwendet. Dies führte zur Unterbrechung der synaptischen Übertragung in vitro und zu einem geringen Anstieg der CA1 PC-Feuerungsrate in vivo nach systemischer Injektion von hM4D-Clozapin-n-Oxid (CNO) in vivo. Ich stellte fest, dass die Behandlung in vivo mit CNO keinen Einfluss auf die Steigungen, die zirkulär-lineare Korrelation, Offset oder den Phasenbereich der in der Einzeltrial-Analyse gemessenen PP hatte. Das Vorhandensein von Place Cells sowie deren räumliche Eigenschaften wurden durch die CNO-Behandlung nicht verändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass L3PCs im MEC ein wichtiger Organisator von rhythmischer Aktivität und Slow Oscillations sind, aber dass sie nicht entscheidend für die PP und andere räumliche Kodierung in CA1 sind. Diese Arbeit kann dazu beitragen, eine Verbindung zwischen zell- und schichtspezifischer Pathologie bei verschiedenen Erkrankungen herzustellen, sowie mechanistische Erklärungen für kognitive Symptome zu liefern