Hemoglobin-based oxygen carriers: in vitro hemocompatibility and functionality

Hemoglobin microparticles (HbMP) present a promising alternative for allogenic blood transfusions. The peanut shaped HbMP show an average size of about 400 nm x 700 nm. However, it is necessary to thoroughly characterize such artificial blood substitute for clinical approval. Physical properties of HbMP must be determined. The HbMP must be investigated in vitro regarding their function, pharmacokinetics and toxicity. Additionally, it is essential to evaluate the hemocompatibility of the particles. In this study, HbMP were fabricated by the co-precipitation, crosslinking and dissolution (CCD) technique using two different crosslinking agents. The functionality was determined by spectral extinction measurements and hemocompatibility was investigated. The CCD technique allows the fabrication of biopolymer particles with bioactive components. Relevant parameter – such as size, shape and entrapment efficiency – were optimized by varying the minerals used as templates. Particles prepared with MnCl2 and Na2CO3 exhibit a protein entrapment efficiency of nearly 100 %. Hyaluronic acid could not influence entrapment efficiency, morphology and size of HbMP. The procedure to investigate the functionality of HbMP is based on spectral extinction measurements between 300 nm and 850 nm. The optical setup features a white light source collimated to obtain a low divergence. In contrast to commercial devices, this setup allows rapid measurements within 10 s and the detection of collimated spectral transmittance under defined conditions. The observed wavelength range includes absorption bands for the important hemoglobin variants necessary to determine the functionality of the particles. Due to the differences of the three absorption bands of oxygenated and deoxygenated hemoglobin as well as methemoglobin, the quantities of these three variants are accessible at a known HbMP concentration. Hence, the functionality of the particles was determined. A modified CCD technique using oxidized dextran as crosslinker was applied to fabricate HbMP with a good hemocompatibility, which was investigated by testing hemolysis and platelet activation. An indirect phagocytosis test was established in order to determine the innate immunological response to HbMP.Hämoglobinmikropartikel (HbMP) stellen als künstliche Sauerstoffträger eine vielversprechende Alternative zur allogenen Bluttransfusion dar. Die hantelförmigen HbMP haben eine typische Größe von etwa 700 nm in der Längsachse und 400 nm in der Querachse. Für die Zulassung klinischer Studien ist es jedoch notwendig sowohl ihre physikalischen Eigenschaften als auch ihre Funktion, Pharmakokinetik und Toxizität zunächst in vitro zu charakterisieren. Von essenzieller Bedeutung für eine Anwendung der Suspensionen der HbMP als Blutersatzstoff sind überdies Untersuchungen zur Hämokompatibilität. Im Rahmen der Arbeit wurden durch Ko-Präzipitation, Vernetzung und Auflösung (co-precipitation-crosslinking-dissolution, CCD) HbMP mit unterschiedlichen Vernetzern hergestellt, ihre Funktionalität durch spektrale Extinktionsmessungen bestimmt und die Hämokompatibilität untersucht. Die CCD-Technik erlaubt die Herstellung von Biopolymerpartikeln mit bioaktiven Bestandteilen. Relevante Parameter wie Größe, Form und Einschlusseffizienz können durch die Variation der mineralischen Matrizen und Reagenzien optimiert werden. Nutzt man MnCl2 und Na2CO3 für die Präzipitation, weisen die Teilchen eine Hantelform auf und die Effizienz des Proteineinbaus erreicht nahezu 100 %. Hyaluronsäure hat keinen Einfluss auf die erreichte Einschlusseffizienz von Hämoglobin. Das Verfahren zur funktionellen Charakterisierung der HbMP basiert auf spektralen Extinktionsmessungen im Wellenlängenbereich von etwa 300 nm bis 850 nm. Der angegebene Wellenlängenbereich schließt die Absorptionsbanden der verschiedenen Hämoglobinvarianten von oxygeniertem bzw. deoxygeniertem Hämoglobin und Methämoglobin ein, so dass diese bei bekannter HbMP-Konzentration quantifiziert werden können. HbMP, die mit oxidiertem Dextran als Vernetzer hergestellt wurden, weisen eine gute Hämokompatibilität auf, so dass dieser Ansatz auch zukünftig verfolgt werden sollte. Als Methoden wurden dabei Tests zur Bestimmung der Hämolyse und der Plättchenaktivierung verwendet. Außerdem wurde ein indirekter Phagozytosetest entwickelt, um die Auswirkungen auf die angeborene Immunantwort zu ermitteln