Investigations with certain pathogens of the honeybee (Apis mellifera L.) with special respect to the viruses

A mézelő méh (Apis mellifera) jelentős szerepet tölt be a bioszférában és a mezőgazdaságban. A kultúrnövények beporzásával hozzájárul a termés mennyiségének növekedéséhez, valamint az általuk termelt termékek több iparágban fontos szerepet töltenek be. A mézelő méh jelentős szerepet tölt be a vadon élő növényfajok diverzitásának fenntartásában is. A méhcsaládok életét és teljesítményüket számos tényező befolyásolja, melyek közül igen nagy jelentőségűek az egyes fertőző betegségek kórokozói, ezért a méhek egészségvédelmében fontos szerepet játszik a fertőző betegségek felismerése, és a kórokozók vizsgálata. Az értekezésben összefoglalt munka célja a magyarországi mézelő méh családokat fertőző vírusok jelenlétének és elterjedtségének kimutatása, a fekete anyabölcső vírus filogenetikai vizsgálata, illetve egy egysejtű parazita által okozott betegség, a Nosema-betegség kórokozójának a vizsgálata volt. Munkánk során monitoring vizsgálatokat végeztünk a mézelő méheket fertőző 6 vírus (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, SBV és IAPV) jelenlétének és elterjedtségének kimutatása érdekében két periódusban: 1999-2004 között 52, és 2007-ben 72 méhészetből gyűjtött minta segítségével. A két vizsgálat eredményeit összehasonlítva információt kaptunk, hogy az Európai Uniós csatlakozás után mennyiben változott a magyarországi mézelő méhek vírusfertőzöttsége. A vizsgálatok azt mutatták, hogy 2004 előtt alacsonyabb volt az öt kimutatható vírus (ABPV, BQCV, CBPV, DWV és SBV) jelenléte Magyarországon más nyugat-európai országokhoz képest. A 2007-es felmérés eredményeképp azt találtuk, hogy a csatlakozás után némely vírus előfordulási aránya és a szimultán vírusfertőzések aránya is megemelkedett a korábbi állapotokhoz viszonyítva. Az amerikai nagy arányú méhpusztulásért felelős izraeli heveny méhbénulás vírust pedig nem sikerült kimutatni. Elvégeztük a fekete anyabölcső vírus közép-európai genotípusainak filogenetikai vizsgálatát. A BQCV genom két különböző területének (ORF1 és ORF2) részleges szekvenciái segítségével 22 magyarországi, ausztriai és lengyelországi vírus filogenetikai törzsfáját készítettük el. A két törzsfa eltérő képet mutatott. Az ORF2 génszakasza alapján készített törzsfán a vírus genotípusainak a filogenetikai csoportosulásai követik a földrajzi elhelyezkedéseket. Az ORF1 génszakasz alapján készített törzsfán nem lehet ilyen földrajzi eredet szerinti csoportosulást megfigyelni. A két törzsfán három lengyelországi vírus eltérő módon helyezkedett el. Annak érdekében, hogy fényt derítsünk ennek okára, egy komplettebb vizsgálatot végeztünk a BQCV néhány genotípusának a genom csaknem teljes hosszán. 57 Ennek eredményeképp azt találtuk, hogy az ORF1 első harmada igen változékony szakasznak bizonyul, bár ennek a területnek a szerepe még tisztázatlan. Az ORF1 második kétharmada a közeli rokonságban álló vírusoknál viszont igen konzervatív volt. Az ORF2 kevésbé volt változékony, mint az ORF1 első harmada, de mivel a mutáció okozta egyedi különbségek ezen a területen kifejezettebbek, ezért elmondhatjuk, hogy ez a terület alkalmasabb filogenetikai vizsgálatra. Találtunk mindkét ORF előtt egy-egy területet, amely 100%-os homológiát mutatott. Lehetséges, hogy ezek a területek génexpressziót szabályozó promóter tulajdonsággal rendelkeznek. A kérdéses három lengyelországi vírusnak a hasonlósága a genomon hírtelen megváltozik, ezért elmondhatjuk, hogy valószínűleg genetikai rekombináció történt, de a jelen tanulmányban a vizsgált vírusok között nem találtuk meg, hogy konkrétan mely genotípussal történt a rekombináció. A mézelő méh Nosema-betegsége világszerte elterjedt. Az európai és magyarországi méhészetekben korábban a Nosema apis okozta ezt a betegséget, mely jelentős károkat képes okozni a méhészetekben. Azonban az elmúlt évek során számos jelentés érkezett, hogy a betegség tünetei nyáron és ősszel is megfigyelhetőek, holott a N. apis csak télen és kora tavasszal okoz tüneteket. Felmerült a kérdés, hogy nem egy Európában eddig új faj, az Ázsiában honos és az eredetileg ázsiai méheket (Apis cerana) fertőző Nosema ceranae terjedt-e el az európai méhészetekben. 2006-ban Spanyolországban sikerült kimutatni a N. ceranae jelenlétét az európai méhcsaládokban. Mivel a két Nosema faj elkülönítése alak alapján igen nehéz, kidolgoztunk egy molekuláris biológiai módszert, mellyel gyorsan és megbízhatóan ki lehet mutatni a Nosema kórokozót, és a két fajt el lehet egymástól különíteni. Az ország egész területéről 38 méhmintát vizsgáltunk meg, minden megyéből legalább egyet, ezáltal a vizsgálat az ország egész területére kiterjedt. A PCR-RFLP módszer segítségével sikerült Magyarországon először kimutatnunk az eddig idegen Nosema ceranae-t, és megállapítottuk, hogy a 38 méhmintában N. ceranae fertőzés volt jelen, míg egy mintában volt csak jelen a korábban jellemző N. apis. Ez azt jelenti, hogy Magyarországon a N. ceranae van többségében jelen a N. apishoz viszonyítva.Honey bees (Apis mellifera L.) play an important role in nature and agriculture. They are the most important pollinators of different plants among the field crops. Besides that bee products were used from ancient times until today, for therapeutic purposes, and consumption. Since the awareness to the importance of bees as producers of food, as well as pollinators and producers of industrial row material have been increased, different bee diseases are regarded with more attention, and scientific research of bee pathogens has been continued with increased effort and interest. The aim of this study was to carry out a survey on the occurence of the most important bee-pathogenic viruses in Hungary, a phylogenetic analyses of Black Queen Cell Virus genotypes, and to diagnose and identify Nosema apis and Nosema ceranae in Hungarian Apis mellifera colonies. This survey aimed to reveal occurence and prevalence of six bee-pathogenic viruses (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, SBV and IAPV) in Hungary. The investigated samples were collected in 2007 from 72 Hungarian apiaries located in different regions of the country. Our researchgroup managed to make a similar survey before joining the EU between 1999 and 2004. In this study we compared the results of the monitoring survey in 1999-2004 to that 2007. After joining the European Union changed the prevalence of the bee infecting viruses in Hungarian apiaries. The results of the earlier survey showed that the prevalence of the five viruses (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, SBV) in Hungarian apiaries was generally lower than that found in surveys performed in France and Austria. In the survey in 2007 we found that after joining the EU the prevalence of some viruses increased. In 2007 there were more simultaneous infections in Hungarian apiaries compared to that in 1999-2004. We have not found the Israeli Acute Bee Paralysis Virus in Hungary, which virus is strongly correlated with the presence of colony collapse disorder in the United States. Phylogenetic analyses of 22 black queen cell virus (BQCV) genotypes collected from honeybee colonies in Poland, Austria and Hungary was performed on a partial ORF1 and partial ORF2. The two phylogenetic tree showed different pictures. The phylogeny based on the ORF2 region showed clustering of the genotypes corresponding to their geographic origin. This clustering on the ORF1 cannot be observed. Three Polish samples showed different distribution on the two tree. In order to investigate this discrepancy in more detail, the nearly complete genome sequences of some BQCV strains were determined. Comparison of the different genome regions revealed that ORF1 was found more variable on the first 1700 nt 59 compared to ORF2. The 3’ proximal ORF1 was more conserve than ORF2 regarding the closely related genotypes. However, ORF2 seems to be a more suitable target region for phylogenetic analysis of BQCV, because the mutation-derived individual sequence changes are more characteristic in this area. The 5'-UTR and the intergenic regions of the BQCV genome are highly conserved with longer homologous sections. These areas usually play central roles in the transcription-initiation and the expression regulation of the subsequent genes. The sudden changes in the similarity levels of the three Polish BQCV strains in different genomic regions are indicative of preceding recombination events. The nosema disease of the European honeybee is present worldwide in bee colonies. Nosema apis was considered as the causative agent of the disease in European and Hungarian apiaries, which may have many negative effect on the colony, and may cause heavy economic losses in apicultures. Nosema apis usually infects bees during the spring in Europe. A new tendency is for parasitic disease to occur at a wider range of season, resulting in infected bees from spring until the beginning of autumn. This has led to the suspicion that a new species Nosema ceranae, that infest originally the Asian honeybee (Apis cerana) is infecting bees in Hungary and other European countries. N. ceranae was first detected in European honeybee in Spain in 2006. Because it is difficult to distinguish N. ceranae and N. apis morphologically, a rapid and accurate assay has been developed to differentiate N. apis and N. ceranae based on PCRRFLP. The assay was tested on 38 Nosema-infested bee samples, which were collected from geographically distant Hungarian bee colonies representing all regions of the country. Only one sample contained N. apis, and the other 37 N. ceranae, which indicates the dominance of N. ceranae in Hungarian apiaries. This is the first report on the presence of Nosema ceranae in Hungary