Investigation of microsatellite polymorphism in degraded canine samples

A kutyák mikroszatellita (STR) alapú polimorfizmus-vizsgálata tenyésztési (leszármazási) vagy igazságügyi (egyedazonossági) célból az utóbbi időkben egyre inkább elterjedt. Az eseti minták nagy része azonban a forgalomban lévő „kutya kit”-ekkel vizsgálva csak részben, illetve egyáltalán nem értékelhető genetikai profilt eredményez. A fiziológiás állapotukat vesztett, bomlásnak indult vagy már bomlott anyagmaradványokban a fizikailag hosszabb lokuszok nagyobb valószínűséggel károsodnak, így a töredezett DNS vizsgálata során a nagyobb méretű (kb. 300 bázispárt meghaladó) szakaszok amplifikálása PCR technikával sokszor ellehetetlenül. Vizsgálatom olyan újabb mikroszatellitákra irányult, amelyek e problémát kiküszöbölendő, megfelelő változatossággal valamint kellően rövid mérettel rendelkeznek. Munkám során öt mikroszatellita marker (PEZ19, PEZ16, REN124, WILMS-TF, FH2584) – amelyek hossza az új primerek tervezésével nem haladja meg a 200 bázispárt – , valamint két, eredendően rövid (PEZ21, vWF.X) marker polimorfizmusát mértem fel 75 fajtába tartozó, 116 egymástól genetikailag független kutya mintáján. A PCR technikával sokszorozott, fluoreszcensen jelölt termékek elválasztását és méretének meghatározását kapilláris elektroforézissel végeztem. Az adott allélek szekvencia analízisével meghatároztam szerkezetüket, és az ismétlődő egységek alapján nemzetközi összehasonlításra is alkalmas allélnevezéktant alakítottam ki. A szekvenálással igazolt méretű referencia allélekből összeállított alléllétrákkal és az alkalmazott kutya markerekre megírt Genotyper 2.5.2 szoftver használatával lehetővé tettem az allélek félautomata kiértékelését (genotipizálását). Az allélgyakorisági adatok alapján statisztikai analízist végeztem, meghatározva az egyes lokuszok heterozigozitását (Hexp, Hobs), a megkülönböztetési megbízhatóságot (PD), az apasági kizárás megbízhatóságát (PE) és a polimorfizmus információs tartalmat (PIC). A vizsgált hét STR lokusz-készletet kiegészítettem a már korábban leírt PEZ1, PEZ3, PEZ5, FH2054 markerrel valamint az SRY lokusszal, és az összesen 12 markert két miniplex reakcióként állítottam össze. A két vizsgálórendszert kis mennyiségű DNS mintákra érzékenyítettem, amelynek eredményeként alkalmasnak bizonyultak akár 0,1 ng össz-DNS tartalmú, degradált minta genetikai profiljának meghatározására. A két miniplex rendszer gyakorlati alkalmazhatóságát bűnügyi helyszínről biztosított szőrminta azonosításán, valamint kérdéses leszármazás eldöntése kapcsán igazoltam. Mivel az eseti minták nagy része szőrszálakra korlátozódik – a kutyák közkedveltségéből és széles körű tartásából adódóan –, háttérvizsgálatként teszteltem, milyen sikerességgel generálható egyetlen szőrszálból az adott egyed valós genetikai profilja. 8 A szomatikus mutáció megléte kutyaszőrben is igazolt, de előfordulási gyakorisága valamint a genotipizálás során fellépő, az eredetitől eltérő DNS-mintázatok megjelenésére vonatkozó adatok nem állnak rendelkezésre. A bullmasztiff fajtájú donortól biztosított, összesen 600, különböző testrészekről kitépett szőrszálak gyökérhüvelyi részének fénymikroszkópos ellenőrzése alapján az eltérő növekedési fázisban lévő szőrképleteket három kategóriába soroltam (anagén, katagén, késői katagén). A levágott szőrhagymákból három különböző preparálási eljárással teszteltem az alacsony kópiaszámú DNS izolálására alkalmas technikákat. A StockMarks® Dog Genotyping Kit segítségével 10 STR lokusz (PEZ1, FHC2054, FHC2010, PEZ5, PEZ20, PEZ12, PEZ3, PEZ6, PEZ8, FHC2079) együttes sokszorozását végeztem el, az elektroforézishez és a genotípus meghatározásához ABIPrism 310 Genetic Analyzer készüléket, Genescan 3.1 és Genotyper 2.5.2. szoftvereket használtam. A teljes genetikai profilt adó szőrszálakból meghatároztam az egyed valós genotípusától eltérő – allélkiesést, erőteljes kiegyensúlyozatlanságot mutató vagy extraalléles – DNS-mintázatokat. Az adott lokuszokon megfigyelt eltéréseket monoplex és/vagy új multiplex vizsgálatokkal ellenőriztem, amelynek eredményeként a szőrminták többségében az egyed valós genotípusa volt kimutatható. Egy esetben az ismételt analízisek ellenére is eltérő allélmintázatot mutattam ki, amelynek következtében igazolhatóvá vált, hogy a vizsgált egyed szomatikusan mozaikos. Megfigyeléseim összességében a szőrszálak DNS-vizsgálatán alapuló egyedazonosítás nehézségeire hívják fel a figyelmet. Az alacsony kópiaszámú minták analízisekor a felerősödő technikai egyenetlenségek hibás genetikai profil meghatározásához vezethetnek, és tized-ezrelékes nagyságrendű gyakorisággal szomatikus mutációk is előfordulhatnak. A tényleges genotípus meghatározása érdekében – ha lehetőség van rá – ajánlatos az ellenőrző mono- vagy multiplex PCR vizsgálatok elvégzése