Rôle de l'efflux actif de type RND dans la résistance aux antibiotiques chez Pseudomonas sp.

Antibiotics are major contributors to the modern therapeutic arsenal used to combat bacterial infections. However, these last decades have seen the emergence of multi-drug resistant strains, including the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, acknowledged as a priority target for the development of new treatment strategies by the World Health Organization. Its phylogenetically close relative, P. putida, is rarely identified in clinical isolates but is an excellent model to study its capacity to acquire and collect resistance mechanisms. The overproduction of efflux pumps of the RND family (Resistance, Nodulation and cell Division) is one of the mechanisms involved in bacterial antibiotic resistance. This overproduction generally follows an alteration of their regulatory pathway through genetic mutation. These systems are able to export an extended spectrum of antibiotics, making them a major element responsible for the development of multi-drug resistance. The characterization of these efflux systems, their substrates and their regulation mechanisms is of primary importance to preserve the activity of antibiotics and to design new therapeutic strategies. This work has been divided in two separate thesis projects. During the first project, we have studied the mechanisms involved in colistin resistance in P. aeruginosa, an antimicrobial peptide used as a last-resort against extremely-drug resistant strains. We have evidenced the major role played by the two-component system (TCS) ParRS, which controls the expression of a wide range of genes, including the arnBCADTEF-ugd (arn) operon involved in the synthesis, the transport and the fixation of aminoarabinose on the lipopolysaccharide, conferring resistance to colistin. We have demonstrated the involvement of the RND efflux pump MexXY(OprM), regulated by the TCS ParRS, in the colistin resistance observed in in vitro selected mutants and clinical strains. The deletion of the mexXY operon leads to a 16- to 128-times reduction of the colistin MIC in the tested strains. However, artificially overexpressing the mexXY operon in the susceptible strain PAO1 did not confer colistin resistance. Thus, the presence of the efflux pump was necessary, but not sufficient to obtain colistin resistance, which seems to be depending on the overexpression of the arn operon. However, the precise mechanism by which the MexXY(OprM) efflux system participates to resistance is still not clear and further studies will be needed for its role to be fully elucidated. The second project led to the characterization of a novel RND efflux pump in P. putida, capable to extrude aminoglycosides, macrolides, fluoroquinolones and cefepim and to participate to intrinsic and acquired resistance to these molecules. We have selected in vitro a mutant derived from the KT2440 wild type strain of P. putida, which had become resistant to all β-lactams except for imipenem, to aminoglycosides, to fluoroquinolones and to macrolids. This mutant overproduced two efflux pumps of the RND family : the TtgABC pump, and an uncharacterized system we decided to call ParXY, for putida aminoglycoside resistance. Whole genome sequencing of this strain revealed that a frame-shift occurred in the gene sucD coding for the succinyl-CoA synthetase, an enzyme of the TCA cycle. This frame-shift was responsible for the consecutive activation of a TCS that we named ParRS, coded by a divergently-transcribed two-genes operon next to the parXY operon. This TCS was constitutively active in the in vitro mutant and responsible for the co-activation of the ParXY and TtgABC efflux pumps. The characterization of a collection of clinical isolates of P. putida revealed the existence of a strain with an impaired sucD gene, concomitant with a similar resistance phenotype as the in vitro-selected mutant. In conclusion, this work increased our knowledge of the involvement of RND efflux systems in the antibiotic resistance of P. aeruginosa and P. putida.Les antibiotiques sont des molécules majeures de l’arsenal thérapeutique moderne contre les infections bactériennes. Cependant, ces dernières décennies ont vu naître émerger des souches résistantes, notamment chez le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, reconnu comme cible prioritaire de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques par l’Organisation Mondiale de la Santé. Son proche parent, P. putida, est rarement identifié dans des prélèvements cliniques mais sa capacité à acquérir des mécanismes de résistance en fait un excellent modèle d’étude. La surproduction des pompes d’efflux actif de la famille RND (Resistance, Nodulation, Cell Division) est l’un des mécanismes impliqués dans la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Cette surproduction survient généralement suite à une altération de leur voie de régulation en raison d’une mutation génétique. Ces systèmes vont permettre d’exporter un large spectre d’antibiotiques, ce qui en fait un élément majeur du développement de souches multi-résistantes. La caractérisation de ces systèmes, de leurs substrats et de leur régulation est primordiale pour préserver l’activité des antibiotiques et designer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce travail de thèse a été divisé en deux projets. Au cours du premier projet, nous avons étudié les systèmes impliqués dans la résistance à la colistine chez P. aeruginosa, un peptide antimicrobien utilisé en dernier recours contre les souches multi-résistantes. Nous avons ainsi mis en évidence le rôle majeur joué par le système à deux composants (S2C) ParRS, qui contrôle l’expression de nombreux gènes, notamment l’opéron arnBCADTEF-ugd impliqué dans la synthèse et la fixation d’amino-arabinose sur le lipopolysaccharide, conférant une résistance à la colistine. Nous avons mis en évidence l’implication de la pompe RND MexXY(OprM), régulée par le S2C ParRS, dans la résistance à la colistine observée chez des mutants sélectionnés in vitro ainsi que des souches issues de prélèvements cliniques. La délétion de l’opéron mexXY conduit à une diminution de la résistance à la colistine de 16 à 128 fois chez les souches testées. Cependant, la surexpression de l’opéron mexXY chez la souche sensible PAO1 n’a pas suffi à conférer une résistance. La présence de la pompe est donc nécessaire, mais pas suffisante à l’obtention d’une résistance à la colistine, conférée par la surproduction de l’opéron arn. Cependant, le mécanisme par lequel MexXY(OprM) participe à la résistance n’est pas encore compris, et des études supplémentaires seront nécessaires pour mieux définir son rôle. Le second projet a permis la caractérisation d’un nouveau système de type RND chez P. putida, capable de prendre en charge les aminosides, les macrolides, les fluoroquinolones et le céfépime et de participer à la résistance naturelle et acquise à ces molécules. Nous avons sélectionné in vitro un mutant issu de la souche de référence KT2440 qui était résistant à toutes les β-lactamines à l’exception de l’imipénème, aux aminosides, aux fluoroquinolones et aux macrolides. Ce mutant surproduisait deux pompes de type RND : la pompe TtgABC, ainsi qu’une pompe non caractérisée que nous avons nommée ParXY (pour putida aminoglycoside resistance). Le séquençage du génome de cette souche a montré qu’une inactivation du gène sucD, codant pour la succinyl-CoA synthétase du cycle de Krebs, était responsable de l’activation d’un S2C, que nous avons nommé ParRS, codé par un opéron de deux gènes directement en amont de l’opéron parXY. Ce système à deux composants était constitutivement actif dans le mutant in vitro et responsable de la co-activation de ParXY et TtgABC. La caractérisation d’une collection de souches cliniques de P. putida a montré l’existence d’une souche dans laquelle le gène sucD était inactivé avec un phénotype similaire au mutant in vitro. Dans l’ensemble, ce travail a permis de mieux comprendre le rôle des pompes RND chez P. aeruginosa et P. putida