Mechanisms involved in the epigenetic regulation related to the tolerance of herbicides in plants

A regulação mediada por mecanismos epigenéticos tem sido sugerida recentemente como um dos fatores relacionados à variação de efeito e à resistência a herbicidas. Os objetivos deste estudo foram identificar como a exposição a herbicidas pode desencadear alterações epigenéticas em Arabidopsis thaliana e se essas alterações podem estar relacionadas com mecanismos de resistência a herbicidas. Os experimentos foram realizados com A. thaliana Columbia-0 (tipo silvestre-WT), 11 mutantes epigenéticos, e a linhagem L5 de A. thaliana. Os herbicidas utilizados foram glyphosate, imazethapyr e 2,4-D em doses sub-letais de 72, 10,6 e 40,3 g ha-1 , respectivamente. Nas plantas L5, a expressão relativa analisada por qRT-PCR mostrou que β- glucuronidase (GUS) foi de 7 a 12 vezes mais expresso nas plantas tratadas com esses herbicidas. Isso indica que os herbicidas ocasionaram modificações globais na metilação do DNA, que afetam no silenciamento gênico transcricional (SGT). A suscetibilidade aos herbicidas foi afetada em seis dos 11 mutantes epigenéticos testados. O mutante ros1 teve aumento de 20 a 30% na suscetibilidade para glyphosate, imazethapyr e 2,4-D. ROS1 (REPRESSOR OF SILENCING 1) é uma 5-metil-citosina glicosilase, que atua como repressor de SGT. O efeito do imazethapyr sobre a metilação global do DNA (5mdC) foi analisado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Plantas WT tratadas com imazethapyr apresentaram níveis inferiores de 5mdC (5,65%) em comparação ao ros1 tratado e não tratado. A expressão diferencial de genes avaliada por sequenciamento de RNA (RNA-Seq) revelou que 2464 genes foram induzidos no WT e 3323 no mutante ros1. Imazethapyr induziu a expressão de genes relacionados a processos epigenéticos. Ainda, foram identificados 31 genes candidatos envolvidos com a tolerância a imazethapyr, sendo que cinco genes (TT7, HMTDSP, SCAMP, MFSP e XTH10) mostraram a região promotora metilada na análise in silico e revelaram variação nos níveis de metilação nos sítios CG, CHG e CHH em decorrência da aplicação de imazethapyr. O mutante tt4 mostrou que o acúmulo de flavonóides pode ser importante para a tolerância ao imazethapyr em A. thaliana e que genes dessa via biossintética são regulados epigeneticamente por ROS1. Os resultados deste estudo sugerem que ROS1 atua na demetilação do DNA induzido pelos herbicidas. Os herbicidas avaliados podem alterar vias epigenéticas específicas e alguns genes putativos envolvidos na resistência a herbicidas estão sob regulação epigenética. Esses resultados podem contribuir para a compreensão do efeito do herbicida na regulação epigenética associado à evolução da resistência aos herbicidas.The regulation mediated by epigenetic mechanisms has been recently suggested to be related to variation of herbicide effect and herbicide resistance in weeds. The objectives of this study were to identify how exposure to herbicides can trigger epigenetic changes in Arabidopsis thaliana and whether these changes may be related to the known mechanisms of herbicide resistance. The experiments were performed with A. thaliana Columbia-0 (wild-type WT), 11 epigenetic mutants, and the A. thaliana line L5. The herbicides used were glyphosate, imazethapyr and 2,4-D at sublethal doses of 72, 10.6 and 40.3 g ha -1 , respectively. In L5 plants, the relative expression analyzed by qRT-PCR showed that β-glucuronidase (GUS) was 7 to 12 times more expressed in plants treated with these herbicides. These results indicate the occurrence of global modifications in DNA methylation affecting transcriptional gene silencing (TGS). Susceptibility to herbicides was affected in six out of 11 epigenetic mutants tested. The ros1 mutant showed 20 to 30% increase in susceptibility for the three herbicides. ROS1 (REPRESSOR OF SILENCING 1) is a 5-methylcytosine glycosylases, which act as a repressor of TGS. The effect of imazethapyr on global DNA methylation (5mdC) was evaluated by high-pressure liquid chromatography (HPLC). WT plants treated with imazethapyr presented lower levels of 5mdC (5.65%) in comparison to treated and not-treated plants of ros1. Differential expression of genes assessed by RNA sequencing (RNA-Seq) revealed 2464 genes induced in WT and 3323 in ros1 mutant. Imazethapyr induced the expression of genes related to epigenetic processes. Additionally, 31 candidate genes putatively involved in imazethapyr tolerance were identified. An in silico analysis indicated that five of them (TT7, HMTDSP, SCAMP, MFSP and XTH10) have a methylated promoter region and presented varying levels of methylation at GC, CHG and CHH sites. The tt4 mutant showed that the accumulation of flavonoids may be important for tolerance to imazethapyr in A. thaliana and that genes of this biosynthetic pathway are epigenetically regulated by ROS1. The results of this study suggest that ROS1 presents importance to the demethylation process induced by the herbicides, the evaluated herbicides can change specific epigenetic pathways and some putative genes involved in herbicide resistance are under epigenetic regulation. These results can contribute for understanding the herbicide effect associated with the evolution of herbicide resistance