Combinational nanovaccine against colorectal cancer

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O cancro colorectal (CRC) é um dos tipos de cancro com maior prevalência a nível mundial, sendo responsável por um elevado número de mortes anualmente. O CRC resulta da acumulação de mutações genéticas e epigenéticas em células do trato gastrointestinal, nomeadamente em oncogenes e em genes supressores de tumor. Estas mutações acabam por resultar em alterações histológicas e morfológicas do colón, tais como o desenvolvimento de pólipos pré-cancerosos benignos que podem evoluir para neoplasmas e, subsequentemente, para carcinomas invasivos, caso não sejam tratados. Apesar de existirem formas da doença associadas a fatores hereditários, a esmagadora maioria dos casos de CRC são esporádicos e são resultado de mutações em células somáticas. O CRC pode ser curado em fases iniciais da doença, através da remoção cirúrgica do tumor e de quimioterapia. A radioterapia pode também ser útil para reduzir o risco de recorrência do tumor em alguns doentes. Contudo, muitos destes doentes já apresentam metástases na altura do primeiro diagnóstico, e muitos outros desenvolvem metástases ou recorrência local do tumor após remoção cirúrgica do mesmo. Formas metastáticas da doença são normalmente incuráveis e apresentam uma taxa de sobrevivência a 5 anos inferior a 10%. Assim, é necessário o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas capazes de tratar CRC metastático e de induzir remissões prolongadas desta doença. Uma vez que o cancro é uma doença multifatorial, na qual várias vias moleculares de sinalização estão envolvidas, nos últimos anos têm surgido várias abordagens combinatórias, que têm como alvo múltiplas destas vias de sinalização, com vista ao desenvolvimento de um tratamento mais eficaz para o CRC. A imunoterapia tem demonstrado um enorme potencial para tratar vários tipos de cancro, incluindo o CRC. Esta abordagem faz uso da capacidade do sistema imunitário de erradicar células tumorais, de forma eficaz e com melhor tolerância do que outras terapias mais convencionais, como é o caso da quimioterapia. As vacinas terapêuticas para o cancro constituem um exemplo de uma abordagem imunoterapêutica em desenvolvimento, as quais promovem a apresentação de antigénios específicos tumorais às células T, por células dendríticas (DC), resultando assim numa forte resposta imunológica assente na ação de células T ativadas contra as células tumorais. Apesar de promissoras, a sua aplicação clínica tem sido limitada, encontrando-se em estudo a sua associação com outros moduladores do microambiente tumoral de forma a aumentar a sua eficácia, bem como sensibilizar o microambiente tumoral para outras abordagens imunoterapêuticas, aumentando a resposta destes tumores agressivos, por exemplo, a modeladores da função de immune checkpoints. De facto, o microambiente tumoral é constituído por diferentes tipos de células, incluindo células do sistema imunitário, tais como linfócitos T e B, DC e macrófagos. As células tumorais possuem uma enorme influência nas células do microambiente tumoral, tornando-o altamente imunossupressor. Desta forma, as células do sistema imunológico que infiltram os tumores perdem as suas funções anti-tumorais e, em vez disso, promovem o crescimento e capacidade invasiva das células cancerígenas. Em especial, as células T regulatórias (Treg) e os macrófagos associados ao tumor (TAM) são abundantes no microambiente do CRC. As Treg são, em contexto fisiológico, essenciais para prevenir a autoimunidade. No entanto, no microambiente tumoral, estas células produzem moléculas imunossupressoras e inibem a produção de moléculas co-estimulatórias, resultando assim na supressão da maturação das DC e, consequentemente, na inibição da apresentação de antigénio e da resposta imunológica das células T. Os TAM também possuem um fenótipo imunossupressor dentro do microambiente tumoral, o que resulta na indução do desenvolvimento e crescimento tumoral. Para além disso, as células do microambiente tumoral produzem elevadas quantidades de TGF-β. Esta trata-se de uma citocina que apresenta um papel duplo no desenvolvimento e progressão do cancro. Por um lado, nas fases iniciais da tumorigénese, esta molécula regula a proliferação celular e a apoptose das células epiteliais do colón, apresentando um efeito anti-tumoral. No entanto, em fases mais avançadas da doença, existe uma sobrexpressão desta molécula no microambiente tumoral, em particular da isoforma TGF-β1. Durante a carcinogénese do CRC, esta isoforma induz a migração e a invasão das células tumorais, para além de contribuir para a supressão das células do sistema imunitário, através da promoção da infiltração de células Treg. Assim, tanto a presença de TAM como a produção de TGF-β1 no microambiente tumoral estão associadas a um prognóstico negativo para os pacientes de CRC. Esta tese apresenta uma nova abordagem para o tratamento do CRC, que envolve a combinação de uma nanovacina com a modulação do microambiente tumoral, nomeadamente a inibição da expressão de TGF-β1 e a inibição da função pró-tumorigénica dos TAM. Com esse objetivo, foram desenvolvidos dois tipos de nanopartículas (NP) poliméricas, biodegradáveis, constituídas por uma matriz de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA), capazes de incorporar diferentes agentes terapêuticos e de fazer a entrega dos mesmos a diferentes células alvo. Foi desenvolvida assim uma nanovacina capaz de incorporar antigénios peptídicos expressos pelo CRC, os adjuvantes Poly(I:C) e CpG-ODN e moléculas de siRNA anti-TGF-β1 (siTGF-β1) que promovem a inibição desta citocina. Esta NP foi funcionalizada com manose, de modo a promover a sua interação específica com as DC, que expressam abundantemente o recetor CD206 (também chamado recetor da manose) na sua superfície. Para além disso, a mesma nanoplataforma foi modificada de modo a promover o transporte de siTGF-β1, bem como dos imunoadjuvantes CpG-ODN e Poly(I:C) para as células tumorais. Para tal, estas NP foram funcionalizadas com o tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD), que apresenta uma alta afinidade com as integrinas αvβ3/αvβ5, cuja expressão é acentuada na superfície das células tumorais, bem como de células endoteliais associadas a tumores. As NP formuladas apresentaram um diâmetro hidrodinâmico próximo de 200 nm e um índice de polidispersão próximo dos 0.2. Verificou-se também que as nanovacinas foram altamente internalizadas por células apresentadoras de antigénio (APC), nomeadamente macrófagos e DC, in vivo. A internalização das nanovacinas por parte das DC resultou no aumento significativo da molécula co-estimuladora CD86, bem como do complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHCI), indicando que esta levou à maturação das DC. Um estudo in vivo realizado em murganhos com CRC permitiu estudar a eficácia da nanovacina terapêutica (com siTGF-β1 na sua composição), em combinação com a NP direcionada para o microambiente tumoral e ainda em combinação com o Pexidartinib, um inibidor dos TAM. Combinações duplas entre a nanovacina e o Pexidartinib, e triplas com (1) a nanovacina, a NP direcionada ao microambiente tumoral e o Pexidartinib ou (2) a nanovacina administrada por duas vias, subcutânea (s.c.) e intratumoral (i.t.) e o Pexidartinib, foram testadas. A administração da dupla combinação Nanovaccina_ siTGF-β1 + Pexidartinib apresentou resultados mais promissores que a administração individual da Nanovacina_siTGF-β1 e do Pexidartinib, bem como resultados similares às restantes combinações triplas. Embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre os volumes e massas médios dos tumores de animais tratados com as combinações duplas e triplas, observaram-se diferenças ao nível das populações de células do sistema imunitário que infiltraram o tumor. A combinação dupla entre Nanovacina_siTGF-β1 + Pexidartinib resultou em valores médios de volume e massa tumoral semelhantes às restantes combinações. No entanto, esta combinação promoveu uma elevada infiltração de células imunológicas no tumor, nomeadamente células T CD8+, linfócitos T citotóxicos (CTL) e células T natural killer (NK T). Esta tese destaca a importância da nanotecnologia no desenvolvimento de novas terapias para o cancro, nomeadamente para o CRC. O desenvolvimento de uma nanoplataforma capaz de incorporar diferentes biomoléculas com propriedades terapêuticas e de interagir com diferentes células alvo é de extrema importância para aumentar a eficácia do tratamento e para reduzir efeitos secundários adversos. Em particular, destaca-se o desenvolvimento de uma nanovacina que, ao ser combinada com a modulação do microambiente tumoral, através da inibição da expressão de TGF-β1 e das células TAM, parece apresentar resultados promissores num modelo animal de CRC.Colorectal cancer (CRC) is one of the most common types of cancer, responsible for many deaths globally. Despite the improvements in treatment, metastatic forms of the disease are often uncurable, with a 5-year survival rate of less than 10%, highlighting the need for the development of new therapeutic strategies to treat metastatic CRC and to allow prolonged remissions. The development of therapeutic cancer vaccines that can induce a specific, robust T-cell response against cancer cells and promote immune cell infiltration within the tumor has been emphasized as a promising strategy for the treatment of cancer. Nevertheless, the combination with modulators of the tumor microenvironment seems to improve the efficacy of therapeutic cancer vaccines. Combinatorial approaches have emerged as promising strategies for the treatment of CRC, because of the multifactorial nature of the disease. In fact, several aberrant and dysregulated molecular signaling pathways have been associated with CRC progression. The upregulation of TGF-β, in particular of the TGF-β1 isoform, has been connected with tumor cell migration and invasion, as well as, with the suppression of immune cell function. Moreover, M2-like tumor-associated macrophages (M2-TAM), one of the most predominant type of immune cells that infiltrate tumors, also promote tumor growth and invasion, as a consequence of their anti-inflammatory, immunosuppressive and pro-tumoral phenotype. As a result, the presence of both TGF-β1 and TAM in the tumor microenvironment has been associated with a poor outcome for CRC patients. Here, it is reported the anti-tumor efficacy of a combinatorial therapy for the treatment of CRC. This approach involved the development of a polymer-based, biodegradable, multifunctional nanoplatform, able to co-deliver several biomolecules, including CRC neoantigens, CpG and Poly(I:C) immune potentiators and the gene regulator siRNA anti-TGF-β1, to different target cells, DC or tumor cells. In this study, we have developed a nanovaccine suitable for the delivery of combinations of neoantigens of the MC38 cell line of CRC, the Toll-like receptor (TLR) ligands CpG and Poly(I:C) and siRNA targeting the expression of TGF-β1 (siTGF-β1). The surface of this nanovaccine was decorated with mannose to improve the delivery of nanoparticle (NP) payloads to antigen presenting cells (APC), namely to DC by adjusting the mean average size of these carriers. Moreover, the same nanoplatform was functionalized with RGD to promote the delivery of siTGF-β1, CpG and Poly(I:C) to tumor microenvironment. This study assessed the anti-tumor immune mediated effect induced by combining our multifunctional nano-based immunotherapy with an inhibitor of M2-TAM. The administration of the nanovaccine, containing siTGF-β1, with Pexidartinib led to a strong synergistic anti-tumor effect, which restricted tumor growth, improved the infiltration of effector immune cells, in particular antigen-specific CD8+ T cells and subsequently CTL, as well as NK T cells, in an animal model of CRC.Com o patrocínio da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa