Uma nova abordagem na obtenção de fármacos ativos contra a tuberculose: co-fármacos ativados por esterases micobacterianas

Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A tuberculose é uma das doenças infeciosas mais mortíferas do mundo, causada pelo agente patogénico Mycobacterium tuberculosis. O surgimento de novas estirpes resistentes, a elevada toxicidade dos fármacos de segunda-linha e os longos períodos de tratamento são as principais problemáticas para a erradicação desta patologia. É, por isso, urgente a descoberta de novos agentes antituberculose com novos mecanismos de ação rápidos e únicos, e de novas abordagens para combater este problema. A elevada hidrofobicidade e complexidade do envelope celular do Mycobacterium tuberculosis dificulta a passagem de alguns fármacos para o interior da micobactéria, impossibilitando os mesmos de atingir o alvo pretendido e atuar. Assim, com o intuito de desenvolver uma estratégia para ultrapassar esta problemática, procedeu-se à síntese de pró-fármacos mútuos utilizando dois fármacos de segunda-linha utilizados na terapia da tuberculose pertencentes à família das fluoroquinolonas (a ciprofloxacina e a levofloxacina) e álcoois de cadeia longa unidos por uma ligação éster. A priori, estes pró-fármacos aumentariam a lipofilia dos fármacos ciprofloxacina e levofloxacina, podendo facilitar a entrada na micobactéria. Os derivados de ciprofloxacina e de levofloxacina foram obtidos utilizando álcoois com cadeia de 6 a 16 átomos de carbono, através da metodologia descrita por Tehler et al., 2013. Para avaliar a estabilidade química e enzimática, realizaram-se ensaios de estabilidade em plasma humano e em tampão fosfato pH 7,4. De seguida, avaliou-se a atividade antimicobacteriana dos derivados contra a estirpe Mycobacterium tuberculosis H37Rv, determinando a Concentração Inibitória Mínima e a Concentração Bactericida Mínima. Além disso, com o intuito de estudar a possibilidade dos pró-fármacos poderem ser ativados pelas esterases micobacterianas, avaliou-se a estabilidade dos mesmos em homogenatos de Mycobacterium smegmatis. Por fim, realizaram-se ensaios de citotoxicidade em macrófagos THP-1. Todos os ésteres de fluoroquinolonas foram sintetizados com sucesso, apresentando rendimentos entre 19% e 94%. Em relação à atividade antimicobacteriana dos derivados contra a estirpe Mycobacterium tuberculosis H37Rv, observou-se que os compostos com cadeia alquílica curta demonstraram melhor atividade. Além disso, os compostos mostraram ser muito estáveis e resistentes à ação das enzimas no plasma humano e à hidrólise química. Sendo assim, uma vez que os pró-fármacos necessitam de ser biotransformados em fármacos para poderem atuar nas micobactérias, avaliou-se se estes seriam ativados pelas esterases micobacterianas e observou-se que estes permaneceram estáveis em homogenatos de Mycobacterium smegmatis. Assim, dado que estes pró-fármacos não passam pelo processo de ativação, não deverão ser estudados como pró-fármacos, mas sim como fármacos. Realizaram-se também ensaios de citotoxicidade, que revelaram que os compostos são mais tóxicos do que os ácidos correspondentes. Sendo assim, seria importante, futuramente, avaliar-se o modo de ação destes compostos, o que permitirá proceder à otimização dos mesmos.Tuberculosis is one of the deadliest infectious diseases in the world, caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis. The emergence of new drug-resistant strains, the long-time treatment and the high toxicity of second-line drugs are the main problems for the eradication of this pathology. Therefore, it is urgent to find new anti-tuberculosis agents with new mechanisms of action and rapid onset and/or new approaches to overcome this problem. The high hydrophobicity and complexity of the Mycobacterium tuberculosis cell envelope prevents some drugs from passing into the mycobacteria, making it impossible to reach the target. Thus, in order to develop an innovative strategy to overcome this problem, we proceeded to the synthesis of mutual prodrugs using two second-line drugs used in TB therapy belonging to the fluoroquinolone family (ciprofloxacin and levofloxacin) and long-chain alcohols joined by an ester bond. A priori, these prodrugs would increase the lipophilicity of the ciprofloxacin and levofloxacin drugs, which may allow an improved penetration into the mycobacteria. The derivatives of ciprofloxacin and levofloxacin were obtained using alcohols with 6 to 16 carbon chains, through the methodology described by Tehler et al., 2013. In order to evaluate the chemical and enzymatic stability, stability assays were performed in human plasma and in pH 7.4 phosphate buffer. Then, the antimycobacterial activity of the derivatives against Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was evaluated, by determining the Minimum Inhibitory Concentration and the Minimum Bactericidal Concentration. In addition, in order to study the possibility of prodrugs being activated by mycobacterial esterases, their stability in homogenates of Mycobacterium smegmatis was evaluated. Finally, cytotoxicity assays were performed on THP-1 macrophages. All fluoroquinolones esters were successfully synthesized with yields ranging from 19% to 94%. Regarding the antimycobacterial activity of the derivatives, it was observed that the compounds with short alkyl chain showed better activity. In addition, the compounds showed to be very stable and resistant to the action of enzymes in human plasma and to chemical hydrolysis. Thus, since prodrugs need to be biotransformed into drugs to be able to act on mycobacteria, it was evaluated whether they would be activated by mycobacterial esterases and it was observed that they remained stable. Thus, given that these prodrugs do not undergo the expected activation process, they should not be studied as prodrugs, but rather as drugs. In addition, cytotoxicity assays in macrophages were performed and revealed that the compounds are more toxic than the corresponding acids. Therefore, it would be important, in the future, to evaluate the mode of action of these compounds, which will allow them to be optimized.Com o patrocínio da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT); Instituto de Investigação do Medicamento (iMed.ULisboa), Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisbo