Probing the pyrimidine scaffold for malaria liver stage inhibition: synthesis and biological evaluation in P. berghei-infected hepatocytes

Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A malária é uma das principais doenças infeciosas a nível mundial. Em 2018 esta doença infetou 228 milhões de pessoas, das quais 405 mil morreram em todo o mundo. Anualmente são gastos vários biliões de dólares americanos na tentativa de controlar e erradicar a malária. Contudo, apesar do número de casos e mortes causados por esta doença terem vindo a diminuir ao longo dos anos, a Organização Mundial de Saúde considera que demore mais de uma década até que a malária seja totalmente erradicada. A malaria é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium. Em humanos esta doença pode ser causada por cinco diferentes espécies: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi. Destas espécies de Plasmodium, o P. falciparum é a espécie predominante na maioria das regiões afetadas por esta doença, sendo responsável por 99.7% dos casos em África, para além de ser a espécie responsável pela maioria das mortes a nível global. Os parasitas Plasmodium necessitam de dois hospedeiros distintos: um vetor mosquito e um hospedeiro vertebrado. Em humanos, os parasitas são geralmente transmitidos através da picada do mosquito fêmea Anopheles infetado e têm duas fases distintas quando no corpo humano, a fase hepática e a fase sanguínea. Quando o mosquito se alimenta de sangue, liberta os esporozoítos existentes nas glândulas salivares para o sangue do hospedeiro vertebrado. Após entrarem na corrente sanguínea, os parasitas migram para os hepatócitos dando início à fase hepática, assintomática para o hospedeiro. Adicionalmente, é na fase hepática que ocorre o desenvolvimento das formas latentes (hipnozoítos) das espécies P. vivax e P. ovale. Os hipnozoítos podem ficar inativos nas células hepáticas até vários anos. Após a fase hepática, os parasitas regressam à corrente sanguínea para invadirem os eritrócitos, dando começo à fase sanguínea. Dentro dos eritrócitos, os parasitas evitam as defesas imunitárias do hospedeiro e degradam a hemoglobina dos mesmos, permitindo o seu crescimento e replicação. O consumo excessivo de hemoglobina por parte do parasita é a causa dos sintomas no hospedeiro. O tratamento para a malária deve ser iniciado nas primeiras 24 horas após o aparecimento de sintomas. No entanto, os primeiros sintomas causados pelos parasitas Plasmodium são muito semelhantes a outras doenças febris, dificultando o seu diagnóstico. Quando não tratada nestas 24 horas, a malária pode desenvolver-se em malária severa, podendo causar malaria cerebral, ou mesmo a morte. Tradicionalmente, as terapias contra a malária têm a fase sanguínea como alvo. No entanto, a fase hepática é obrigatória e essencial para a maturação e replicação dos parasitas, sendo um alvo importante no controlo e erradicação da malária. De forma geral, os fármacos que atuam na fase sanguínea não têm atividade contra os parasitas hepáticos devido às diferenças biológicas entre as duas fases dos parasitas. Assim, é altamente desejável desenvolver fármacos ativos para a fase hepática, ou para ambas as fases, de modo a exercer profilaxia, erradicar as formas latentes, evitar o aparecimento de estirpes resistentes e bloquear a transmissão dos parasitas para o vetor mosquito. Adicionalmente, outros modos de combater o desenvolvimento de resistência aos vários fármacos são: utilização de terapias combinadas, ou fármacos híbridos. Atualmente, é recomendado pela Organização Mundial de Saúde recorrer a terapias combinadas baseadas em artemisininas para o tratamento da malária, de modo a reduzir o risco de aparecimento de resistência. As artemisininas são compostos apenas ativos contra as formas eritrocíticas, e já existem casos de resistência a estas moléculas. O desenvolvimento de resistência aos vários fármacos é a principal razão para que a terapêutica contra a malária não seja tão eficaz quanto desejado. A cloroquina, fármaco antimalárico que permitiu a erradicação da malária de muitos países, hoje em dia é ineficaz contra os parasitas Plasmodium devido ao aparecimento de estirpes resistentes a este composto. Várias classes de compostos têm atividade contra a fase hepática. No entanto, tem sido difícil desenvolver um fármaco com efeito profilático eficiente devido à falta de conhecimento sobre a biologia dos parasitas hepáticos e respetivos alvos terapêuticos. A primaquina é uma 8-aminoquinolina com potente atividade para os parasitas pré-eritrocíticos, para além de ser um dos poucos fármacos com atividade hipnozoiticida. Além da primaquina, outras 8-aminoquinolinas também exibem atividade profilática, apesar de poucas serem ativas contra as formas latentes como é o caso da tafenoquina. No entanto, o uso desta classe de compostos não é indicado para pessoas com deficiência a nível da enzima glucose 6-fosfato desidrogenase, devido aos seus efeitos secundários. Dentro dos grupos dos antifolatos, alcalóides, antibióticos, anti-histamínicos, inibidores do complexo bc1, pirimidinas, entre outros, podem ser encontradas moléculas com atividade para a fase hepática. Entre os vários compostos abordados destacaram-se dois devido aos seus baixos valores de IC50 na fase hepática: o decoquinato (177 pM) e a nigericina (< 1 pM). O primeiro composto é um inibidor do complexo bc1 da cadeia eletrónica mitocondrial do parasita, enquanto que o segundo composto é um antibiótico ionóforo cujo alvo são transportadores de iões K+. As pirimidinas nitrilo geralmente são compostos ativos para a fase sanguínea. No entanto, Oliveira e colaboradores descobriram uma série de híbridos tetraoxano-pirimidina nitrilo com atividade para ambas as fases do parasita. A unidade pirimidina nitrilo (grupo aceitador de Michael) destas moléculas é um inibidor da falcipaína-2, enzima expressa apenas nos parasitas eritrocíticos. No entanto, a mesma unidade revelou também ter atividade inibitória para os parasitas hepáticos. Isto sugere a existência de um ou mais alvos terapêuticos com um resíduo de cisteína ativo na fase hepática. Apesar de estar descrita a possível atividade antimalárica de tetraoxanos na fase hepática, nestes híbridos essa hipótese não é considerada, pela existência de atividade hepática num composto apenas com a unidade pirimidina nitrilo. Neste projeto foram sintetizados dois compostos com um grupo aceitador de Michael, e com potencial atividade inibitória para as fases sanguínea e hepática. Duas pirimidinas substituídas na posição 2 com uma unidade acrilato, cujas atividades inibitórias contra a malária (fases sanguínea e hepática) e células cancerígenas do tipo estaminais foram avaliadas. No entanto, não foi possível expor o alvo terapêutico destas moléculas na fase hepática. Ao longo do trabalho laboratorial certas reações foram otimizadas. Por exemplo, na obtenção dos compostos finais efetuou-se um acoplamento de Suzuki-Miyaura na posição 2 de duas pirimidinas distintas. Quando esta reação foi efetuada numa pirimidina não substituída na posição 5, o rendimento obtido foi de 6% (composto 64). Por outro lado, verificou-se que a mesma reação numa 5-bromopirimidina levou à obtenção do composto di-substituído, 65, com um rendimento de 13%. Ambos os compostos mostraram ter atividade moderada contra os parasitas hepáticos, o composto 65 exibiu um valor de IC50 = 9.49 μM. O valor de IC50 do composto 64 não foi determinado devido à possibilidade de toxicidade nas concentrações mais elevadas. Quanto à avaliação da inibição de parasitas sanguíneos, apenas um dos compostos mostrou atividade (composto 64), sendo esta reduzida relativamente a outros compostos com grupos aceitadores de Michael. Para além disso, os compostos finais foram também testados numa linha de células cancerígenas do tipo estaminais do cólon humano (HT-29), e ambos apresentaram baixa atividade inibitória. Nos ensaios em monocamada os compostos 64 e 65 apresentaram valores de IC50 = 35.56 μM e 28.96 μM, respetivamente. Nos ensaios em células cancerígenas estaminais do tipo esferóides os valores de IC50 determinados foram de 0.77 μM e 0.70 μM, respetivamente. O facto dos compostos 64 e 65 conterem um grupo na posição 2 que atua como aceitador de Michael, e apresentarem atividade para a fase hepática (composto 64 também apresentou atividade para a fase sanguínea), reforça a hipótese de existir um alvo que contenha uma cisteína ativa para esta mesma fase. Assim, este trabalho serve de diretriz para a síntese de híbridos e sondas químicas estruturalmente relacionadas com os compostos 64 e 65, possibilitando a compreensão do mecanismo de ação destes na fase hepática.Malaria is one of the world major infectious diseases. In 2018 it affected 228 million people worldwide. Human malaria is caused by five species of Plasmodium, of which P. falciparum is the deadliest parasite. Plasmodium parasites are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes. Before the parasites start consuming hemoglobin on the symptomatic blood stage, they need to go through the obligatory and asymptomatic liver stage. Most antimalarial drugs target the erythrocytic parasites. Generally, these drugs have no effect in the hepatic forms of the parasite due to the distinct biology between both stages. Thus, it is highly desirable to target the hepatic stage in order to achieve prophylaxis, eradicate the dormant forms (hypnozoites) caused by P. vivax and P. ovale, and block the transmission of the parasites to the mosquito vectors. Additionally, to oppose the emergence of resistant strains, combined therapies and hybrid drugs can be used. Several compound classes have anti-liver stage activity. However, it has been difficult to develop an efficacious prophylactic drug due to the lack of known liver stage targets. Primaquine is an 8-aminoquinoline antimalarial with potent activity against liver stage parasites and is one of the few drugs with hypnozontocidal activity. As primaquine, other 8-aminoquinolines also have prophylactic activity, despite few being active against the dormant forms such as tafenoquine. However, this compound class is unsuitable for glucose 6-phosphate dehydrogenase deficient individuals. Antifolates, alkaloids, antibiotics and pyrimidines are some examples of classes with compounds active against the liver stage. A series of tetraoxane-pyrimidine nitrile hybrids as dual-stage antimalarials was found by Oliveira and co-workers. The pyrimidine nitrile moiety (a Michael acceptor) exhibited to be active against blood stages by inhibiting the falcipain-2. Although this enzyme is only expressed on the blood stage, this same moiety also exhibited activity against the liver stage. Thus, suggesting the presence of potential target(s) containing an active cysteine on the pre-erythrocytic stages. In this work two compounds with a Michael acceptor group, compounds 64 and 65, were synthetized and their biological activity was evaluated against the BS and LS. Both compounds exhibited mild inhibitory activity to the LS. IC50 of LS was not determined for compound 64 due to possible toxicity, whereas compound 65 exhibited an IC50 = 9.49 μM. However only one of the compounds showed to inhibit BS parasites (compound 64). Furthermore, anticancer activity was tested for both compounds and these exhibited low anticancer efficacy. On the monolayer assay compounds 64 and 65 exhibited IC50 = 35.56 μM and 28.96 μM, respectively. On the CSC-like spheres assay these compounds exhibited IC50 = 0.77 μM and 0.70 μM, respectively