Nutrient sensing in Plasmodium : the role of sirtuins

Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022A malária é uma doença infeciosa causada por parasitas do género Plasmodium, sendo uma das doenças infeciosas mais prevalentes em todo o mundo. O ciclo de vida do parasita divide-se entre um hospedeiro invertebrado (mosquito) e um vertebrado (humano). No Homem, o parasita começa por se estabelecer no fígado (hepatócitos) e, posteriormente, no sangue (eritrócitos). Quando os parasitas invadem os glóbulos vermelhos, podem dar origem a gametócitos (após alguns ciclos) ou iniciam um processo de replicação assexuada que culmina numa nova geração de merozoítos que infetam novas eritrócitos. Isto conduz a um aumento da parasitémia que está associada à gravidade da doença. Os eritrócitos infetados com P. falciparum têm a capacidade de sequestrar dentro dos pequenos e médios vasos, impedindo a eliminação dos parasitas através do baço, isto leva ao aparecimento de lesões celulares e obstrução microvascular. Esta sequestração está associada à progressão para malária cerebral, uma das formas graves desta doença. Este fenótipo está dependente de uma família de proteínas (P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1)), sendo a sua atividade dependente da transcrição dos genes var. O parasita tem a capacidade de mudar entre aproximadamente 60 genes var, usando um mecanismo epigenético, dependente das sirtuínas, que garante que apenas uma PfEMP1 é expressa de cada vez, permitindo que o parasita escape ao sistema imune do hospedeiro. A biomassa do parasita é outro fator que influencia a gravidade da doença e está associado à quantidade de parasitas presentes no sangue periférico. Ambos os fatores contribuem para o agravamento da doença, devendo assim ser o foco de futuros estudos no que diz respeito ao desenvolvimento de drogas anti-maláricas. Atualmente, existem 14 medicamentos aprovados para tratar a malária, como é o caso da artemisinina e os seus derivados. O principal problema destes tratamentos está relacionado com é o rápido desenvolvimento de resistências que impede a erradicação da malária. Apesar de, em outubro de 2021, a vacina RTS,S/AS01 ter sido aprovada pela Organização Mundial de Saúde para uso em crianças, esta apresenta uma eficácia moderada em termos de extensão e duração da imunidade que diminui rapidamente em zonas em que a taxa de transmissão é elevada. Assim sendo, os esforços devem ser direcionados para o desenvolvimento de uma vacina eficaz que permita a erradicação da malária em todo o mundo ou novos tratamentos. A restrição calórica consiste numa redução da ingestão calórica total sem desnutrição. Associam-se à restrição calórica alguns benefícios que estão relacionados com um mecanismo subjacente que os organismos utilizam para se adaptarem eficientemente à falta de nutrientes e que estão comumente associados a uma melhoria no estado de saúde. Sendo o caso de certas patologias associadas ao envelhecimento, mas também a infeções causadas por microrganismos. A diminuição de nutrientes é uma condição que exerce pressão sobre o organismo para selecionar mecanismos eficientes de deteção de nutrientes. Um dos exemplos mais descritos na literatura é a interação AMPK-SIRT1. Está descrito que a diminuição dos níveis de glicose causa uma ativação da AMPK, acompanhada por um aumento da síntese de NAD+ e subsequente diminuição dos níveis de nicotinamida, ambos os processos associados à atividade das sirtuínas. Existem também alguns compostos que podem ativar diretamente as vias envolvidas na resposta à restrição calórica e imitar os benefícios associados sem que haja uma diminuição da ingestão de nutrientes. Estes compostos são conhecidos como miméticos de restrição calórica, e alguns exemplos são o SRT2104, um ativador altamente específica para SIRT1 em mamíferos, e o ácido salicílico um ativador da AMPK. Demonstrou-se que a utilização destes compostos está associada ao aumento da atividade destas proteínas, recriando os benefícios da restrição calórica. Plasmodium spp. também possui mecanismos de deteção de nutrientes que permitem sentir mudanças nutricionais do hospedeiro, alterando a sua taxa de crescimento. Num trabalho recente do nosso grupo foi identificado que durante a fase sanguínea da infeção os parasitas podem sentir as alterações nutricionais do hospedeiro, levando a alterações na replicação. Esta atividade é mediada por uma cinase relacionada com AMPK, KIN. No entanto, continua a não ser claro como é que esta proteína interage com outras e como é que a resposta é construída para culminar num menor crescimento de parasitas em ambientes de restrição calórica. De acordo com o estado de arte atual, as sirtuínas são descritas como sensores de energia em leveduras e mamíferos. Apesar do parasita da malária ter duas sirtuínas (SIR2A e SIR2B), até ao momento nenhuma foi descrita como um mecanismo de deteção de nutrientes. PfSir2a está associada à patogénese e persistência da malária devido à regulação epigenética de genes de virulência são vitais para o P. falciparum (genes var e rifin). Além disso, foi demonstrado que o PfSir2a tem um papel importante na síntese do RNA ribossomal eucariótico, que determina o crescimento e a proliferação celular. A sobre expressão de PfSir2a diminui os níveis de rRNA, levando consequentemente a uma diminuição dos níveis de merozoítos durante a fase sanguínea da infeção. Também está descrito que parasitas que não apresentam o gene que codifica esta proteína produzem um número mais elevado de merozoítos, sugerindo o envolvimento desta proteína na regulação de síntese de ADN. A atividade das sirtuínas parece estar dependente do estado metabólico, visto que é regulada pelos níveis de NAD+. Seguindo esta linha, a PfSir2a pode potencialmente atuar como um sensor metabólico, ao regular a proliferação do parasita em resposta à restrição calórica. Para validar esta hipótese, usámos métodos genéticos e químicos para compreender o papel das sirtuínas na resposta do parasita à restrição calórica e como a interação KIN-SIR2A molda esta resposta. Assim, neste estudo, investigámos o papel das sirtuínas na resposta do Plasmodium spp à restrição calórica. Para esse efeito, acompanhámos in vivo, por citometria de fluxo e microscopia, a progressão da fase sanguínea da infeção de parasitas WT e SIR2a KO em ratos BALB/c sujeitos ou não a restrição calórica. Adicionalmente a análise foi também feita in vitro, verificando por microscopia o desenvolvimento dos parasitas (WT e SIR2a KO), por um ciclo, quando expostos a condições de restrição calórica e a miméticos de restrição calórica. Após a verificarmos que a resposta à restrição calórica no P. berghei é dependente da SIR2A, ensaios in vitro foram também replicados em culturas de P. falciparum , no entanto por se tratar de um parasita que infeta humanos não foi possível recriar um ambiente de restrição calórica usando soro de ratazana, optamos então por apenas usar os miméticos de restrição calórica para estudar o comportamento deste parasita quando as vias são ativadas. Observámos que ambos os parasitas (WT e SIR2A KO) apresentam uma diminuição do crescimento quando expostos a estes compostos, o que pode sugerir um efeito off-target das drogas ou mecanismos diferentes de resposta à restrição calórica nas duas espécies do estudo, o que levanta novas questões para estudos futuros. Os nossos resultados mostram que a ativação de uma das sirtuínas, SIR2A, em Plasmodium spp. desempenha um papel fundamental na resposta à restrição calórica, diminuindo o número de merozoítos por esquizonte. Estes resultados são apoiados pelo facto dos parasitas mutantes, in vitro, apresentarem o mesmo número de merozoítos por esquizonte em condições ad-libitum e em restrição calórica. Paralelamente, também estabelecemos pela primeira vez que, à semelhança de outras espécies, existe uma via envolvida na resposta à restrição calórica que é dependente da interação KIN-SIR2A. Este trabalho dá-nos o primeiro vislumbre de um mecanismo altamente conservado noutros organismos que também está presente no Plasmodium spp., abrindo uma nova porta de investigação envolvendo o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento.Malaria is an infectious disease caused by parasites of the Plasmodium genus and is one of the most prevalent infectious diseases worldwide. Plasmodium has a complex life cycle divided between an invertebrate (mosquito) and vertebrate host (human). In humans the parasite cycle starts by stabilising in the liver (hepatocytes) and then in red blood cells (RBCs). When parasites invade erythrocytes, they can go through a sexual development that culminates into the formation of gametocytes (after some cycles) or start an asexual replication process that culminates in a new generation of merozoites that will infect new RBCs. This results in an increase of parasitemia that is associated with the severity of disease. New insights into how Plasmodium spp. senses host nutritional status were previously provided by our group, highlighting the role of the putative AMPK homologue, KIN. However, it remains unclear how KIN interacts with other proteins and how the response is built to culminate in lower parasite growth in caloric-restricted environments. According to the current state-of-art, sirtuins are also described as energy sensors in yeast and mammals. Despite Plasmodium spp. having two sirtuins (SIR2A and SIR2B) , neither have yet been described as a mechanism of nutrient sensing. In this work, we made use of genetic and chemical approaches to understand the role of sirtuins in the parasite response to CR and how SIR2A interacts with KIN to shape this response. Our results show that in response to CR, SIR2A acts as a negative regulator of replication in a KIN-dependent manner. This work gives us the first glimpse of a highly conserved pathway in other organisms that is also present in Plasmodium spp., opening a new door of research involving the development of new treatment strategies