Caracterização da resistência aos antibióticos em estirpes isoladas de diferentes reservatórios ambientais

Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA resistência aos antibióticos é um problema emergente de Saúde Pública, que tem causado uma elevada mortalidade devido ao aparecimento de clones multirresistentes para os quais não existe um tratamento eficaz. Apesar deste problema estar principalmente associado aos cuidados de saúde outros reservatórios de genes de resistência aos antibióticos, tais como os animais, as águas e os solos, têm vindo a ganhar alguma relevância, numa perspetiva Uma Só Saúde. Neste âmbito, este trabalho teve como principal objetivo a caracterização da resistência aos antibióticos em estirpes isoladas de diferentes reservatórios ambientais aquáticos. Foram isoladas 143 estirpes bacterianas pertencentes a 45 espécies diferentes. Dada a importância em termos de saúde pública das espécies pertencentes ao Enterobacter cloacae complex e sendo uma das espécies mais representadas nos reservatórios analisados (n=29, em 5 reservatórios: água do rio e afluente, água de superfície, lamas e efluente de uma lagoa de estabilização), procedeu-se à respetiva caracterização da suscetibilidade aos antibióticos. A realização de testes fenotípicos (por difusão em disco e determinação da concentração inibitória mínima) foi efetuada para 7 classes de antibióticos, permitindo direcionar a pesquisa de genes de resistência por PCR (Polymerase Chain Reaction). A determinação da diversidade genética foi realizada recorrendo ao MLST (Multilocus Sequence Typing). A sequenciação total do genoma foi realizada para as estirpes que apresentavam um fenótipo mais relevante com o objetivo de identificar genes de resistência a antibióticos, fatores de virulência, plasmídeos, e respetivo pMLST, e outros elementos genéticos móveis (MGE), MLST, profagos e foi determinada a patogenicidade para os humanos utilizando ferramentas online. A análise filogenética foi efetuada com recurso ao CSI Phylogeny v1.4. A maioria das estirpes de E. cloacae complex estudadas possuía um fenótipo de suscetibilidade a todos os antibióticos testados, com exceção das resistências naturais. No entanto, destaca-se a resistência a pelo menos um dos carbapenemes estudados e à colistina em 86% e 93% das estirpes, respetivamente. Globalmente, foram identificados genes relacionados com uma diminuição da suscetibilidade aos antibióticos β-lactâmicos (blaFRI-8, blaIMI-6 e blaACT-tipo), quinolonas (oqxAB-tipo), fosfomicina (fosA2- tipo), macrólidos (mdfA-tipo) e ainda uma grande variedade de bombas de efluxo. Foram também detetados: um fator de virulência (iroN), plasmídeos [IncFII(Yp), Col(MG828), Col(pHAD28)], e diferentes elementos genéticos móveis (MGE). O estudo da diversidade genética permitiu identificar 5 STs diferentes, sendo o ST1688 o predominante, estando presente em 83% das estirpes, em 4 dos 5 reservatórios ambientais estudados. A análise filogenética agrupou as estirpes em três clades principais, contendo estirpes de diferentes reservatórios e estações do ano, variando entre si entre 6 e 49517 SNPs. Em conclusão, este estudo demonstrou uma grande diversidade de genes de resistência e MGE em estirpes de E. cloacae complex isoladas de ambientes aquáticos, confirmando que estes podem funcionar como um reservatório de bactérias resistentes, e de genes de resistência a antibióticos, que podem ser patogénicas para o Homem. Assim, será necessária a implementação de uma rede de monitorização e vigilância não só nas águas, mas também em outros reservatórios ambientais por forma evitar a sua disseminação.Antibiotic resistance is an emerging Public Health problem that causes high mortality due to the emergence of multidrug-resistant clones for which there is no effective treatment. Despite this problem being mostly associated with healthcare facilities, other antibiotic resistance reservoirs have gained some relevance such as animals, water, and soils, in a One Health perspective. The aim of this study was to characterize the antibiotic resistance in strains isolated from different aquatic environmental reservoirs. In total, 143 strains belonging to 45 different species were isolated. Characterization of antibiotic resistance was performed in Enterobacter cloacae complex strains due to their importance in Public Health and for being one of the most represented species in the analyzed reservoirs (n=29, in five reservoirs: river water, and affluent, surface water, sewage sludge and effluent of a wastewater treatment plant). Phenotypic characterization (by disk diffusion and minimum inhibitory concentration) was done for seven antibiotic classes, allowing the oriented search of antibiotic resistance genes by PCR (Polymerase Chain Reaction). The genetic diversity was studied using MLST (Multilocus Sequence Typing). Whole Genome Sequencing was performed for a subset of 12 strains presenting the most relevant phenotypes. Freeware web-based tools were used to identify antibiotic resistance genes, virulence factors, plasmids and respective pMLST, and other mobile genetic elements (MGE), and determine the pathogenicity for humans. Phylogenetic analysis was performed by using CSI Phylogeny v1.4 with default options. Most of the strains were susceptible to all antibiotics tested except the natural resistances. However, 86% were resistant to at least one carbapenem and 93% were resistant to colistin. Globally we identified genes related with a decreased susceptibility to β-lactams (blaFRI-8, blaIMI-6, and blaACT-type), quinolones (oqxAB-type), fosfomycin (fosA2-type), macrolides (mdfA-type) and several efflux pumps. We also detected virulence factor (iroN), plasmids [(IncFII(Yp), Col(MG828), Col(pHAD28)], and different MGE. The study of the genetic diversity allowed identifying five different STs: ST1688 was the most represented, being identified in 83% of strains, in four of the five studied environmental reservoirs. The phylogenetic analysis identified three main clades, differing between 6 and 49517 SNPs, with closely related strains from different reservoirs and seasons. In conclusion, this study demonstrated the diversity of antibiotic resistance genes (ARGs) and MGE within E. cloacae complex strains isolated from different aquatic environments, confirming that they can act as a reservoir of antibiotic resistant bacteria and ARGs that can be pathogenic to humans. Thus, it it necessary to implement a monitoring and surveillance network not only in water, but also in other environmental reservoirs to avoid their dissemination