Development of a Murine Model for the Exploration of the Biological Effects of External Volume Expansion. Sviluppo di un modello murino per l'esplorazione degli effetti biologici dell'espansione volumetrica esterna

Background: External Volume Expansion (EVE) refers to a class of devices that non-invasively stretch and expand tissue compartments by external application of suction. EVE has been suggested to increase compartments volume and stimulate the formation of a more developed vascular network, leading to less stiff and better vascularized tissues. It is proposed to patients as a method to prepare recipient sites, in particular breasts, in view of a fat grafting procedure, basing on the theory that fat grafts will better survive and retain volume if the recipient site is more vascularized and provides less compression. However, the method requires high patient compliance and no experimental validation for it has been attempted. Aims: basing on our group's previous experience in downsizing and testing in animal models clinical devices for wound healing, in particular in settings requiring the application of mechanical forces to soft tissues, we proposed to design an animal model for EVE in which to test the validity of the hypothesis of its being beneficial to fat grafting and explore its mechanisms and potentials. Methods: we designed and built a miniaturized EVE device to be applied to the dorsum of mice. We then designed a series of stepwise incremental studies. We tested the capacity of EVE of inducing angiogenesis and cell proliferation with 28 days long continuous stimulation. We analyzed its effects on tissues in terms of mechanical stretch, hypoxia and ischemia, edema, inflammation, cell proliferation and angiogenesis after a single 2 hours stimulation. We produced a mathematical modeling for the effects of EVE on tissues in relation to fat grafting. We tested if EVE is beneficial to fat grafting and if beneficial effects are maintained also in the setting of chronic radiation damage. We tested if EVE can stimulate adipogenesis and what role inflammation can play in it. Results: in our series of studies, we successfully designed a miniaturized animal model in which to test External Volume Expansion. We demonstrated that the hypotheses of stimulation of cell proliferation, angiogenesis, and expansion of tissue compartments on which it is proposed as a preparatory method to fat grafting is confirmed in experimental settings. We showed how mechanical stretch of tissues, hypoxia and ischemia, edema, and inflammation are all intervening factors that can contribute to these effects. Our results suggest that pre-stimulation with EVE is successful in achieving increased fat graft weight and volume retention, and that its beneficial effects are maintained also in the setting of recipient sites having sustained radiation injury. We also demonstrated that EVE has a potential for direct stimulation of adipogenesis, and gathered supportive results to a role for macrophages in this. Discussion: our results validate the technique for its use in the preparatory phase to fat grafting, and can help moving towards making fat grafting a more effective and reliable procedure with improved outcomes for patients. We gathered evidence that help increasing our understanding of how EVE works and what it implies for tissues. This is the basis for optimizing the technique, make it safer, and increase patients' compliance. For example, stimulation patterns can be improved, duration of treatment can be reduced, and practices such as continuation of EVE after fat grafting should be abandoned as detrimental. Our unexpected observations on adipogenesis also open interesting opportunities, such as that of re-starting EVE after fat grafting when this is at the peak of its remodeling phase. And linking this effect with the understanding of the similarity to other conditions in which adipogenesis is seen and desired, such as tissue engineering, or pathological, such as lymphedema, can expand the potential of our animal model to alternative broader fields.Introduzione: Espansione Volumetrica Esterna (EVE) si riferisce ad una classe di dispositivi che distendono ed espandono compartimenti tissutali in modo non invasivo attraverso l'applicazione dall'esterno di suzione. E' stato suggerito che EVE aumenti il volume dei compartimenti tissutali cui viene applicata e che stimoli un arricchimento della rete vascolare, portando a tessuti meno rigidi e meglio vascolarizzati. Viene proposta a pazienti come metodo per preparare un sito ricevente, soprattutto il seno, in vista di una procedura di innesto di tessuto adiposo con la tecnica del lipofilling, sulla base della teoria che l'innesto sopravvivrà e manterrà il suo volume meglio se il sito ricevente è più vascolarizzato e vi è sottoposto a meno compressione. Tuttavia, il metodo è impegnativo per le pazienti e proposto in assenza di validazione sperimentale delle ipotesi. Scopi: sulla scorta delle precedenti esperienze del nostro gruppo nel realizzare modelli sperimentali animali per dispositivi clinici nel campo della guarigione delle ferite, e in particolare di dispositivi per l'applicazione di forze meccaniche a tessuti molli in vivo, ci siamo proposti di realizzare un modello animale per EVE in cui testare la validità dell'ipotesi che possa offrire benefici all'innesto di tessuto adiposo ed esplorarne i meccanismi e il potenziale. Metodi: abbiamo realizzato un dispositivo per EVE miniaturizzato da applicare al dorso di topi. Abbiamo quindi disegnato una serie di studi con ipotesi e obiettivi incrementali. Abbiamo testato la capacità di EVE di stimolare angiogenesi e proliferazione cellulare applicandola in modo continuo per 28 giorni. Abbiamo analizzato i suoi effetti sui tessuti in termini di stiramento meccanico, ipossia, ischemia, edema, infiammazione, proliferazione cellulare e angiogenesi dopo una singola stimolazione da due ore. Abbiamo elaborato una teorizzazione matematica per gli effetti di EVE sui tessuti in relazione all'innesto di tessuto adiposo. Abbiamo testato se abbia un effetto positivo sull'innesto e se i suoi effetti positivi siano mantenuti nel caso di sito ricevente che abbia sostenuto danno da radiazioni. Abbiamo testato se EVE può timolare l'adipogenesi e che ruolo possano avere in questo i fenomeni infiammatori. Risultati: nella nostra serie di studi, è stato realizzato con successo un modello miniaturizzato con cui testare EVE. Abbiamo confermato sperimentalmente le ipotesi che induca proliferazione cellulare, angiogenesi e espansione dei compartimenti tessutali sulla base delle quali viene proposta come metodo preparatorio all'innesto di tessuto adiposo. Lo stiramento dei tessuti, l'induzione di ipossia e ischemia, edema e infiammazione sono tutti fattori che intervengono e possono contribuire a questi effetti. I nostri risultati suggeriscono che la pre-stimolazione con EVE possa essere efficace nell'ottenere un superiore mantenimento di massa degli innesti di tessuto adiposo, e che gli effetti positivi siano mantenuti anche in tessuti che abbiano subito danno da radiazione. Abbiamo inoltre dimostrato che EVE ha il potenziale di stimolare direttamente fenomeni adipogenici, e raccolto evidenze in favore di un ruolo primario dei macrofagi per questo effetto. Discussione: I nostri risultati offrono supporto sperimentale all'uso di EVE nella fase preparatoria agli innesti di tessuto adiposo, e possono contribuire a rendere l'innesto di tessuto adiposo una procedura più efficiente e prevedibile con maggiori garanzie per i pazienti. Abbiamo raccolto osservazioni che aiutano a comprendere come EVE funzioni e cosa implichi per i tessuti, il che è la base per ottimizzarla, renderla una tecnica più sicura, e aumentare la compliance dei pazienti. Ad esempio, i pattern di stimolazione possono essere migliorati, la durata del trattamento può essere ridotta, e pratiche come quella di riapplicare EVE subito dopo l'innesto di tessuto adiposo dovrebbero essere abbandonate in quanto dannose. La nostra inaspettata osservazione di effetti adipogenici diretti prospetta interessanti alternative, come quella di riapplicare EVE quando un innesto di tessuto adiposo è al picco della sua fase di rimodellamento. E collegare questo effetto con altre condizioni in cui adipogenesi è desiderata, ad esempio in ingegneria tissutale, o patologica, come nel linfedema, può ulteriormente espandere le potenzialità del nostro modello animale ad applicazioni in campi più vasti