Basis of herbicide resistance in two troublesome summer weeds, Echinochloa crus-galli and Sorghum halepense

Herbicide resistance is a worldwide problem and is evolving fast even in Italy, mainly in areas where monoculture and poor rotation of herbicide modes of action are common practices. Furthermore, reduction in number and diversity of active ingredients available due to the implementation of the EU regulations, as well as the widespread use of highly-active herbicide groups, which are target site specific, will increase the risk of resistance and make its management harder. The main guideline of my project was the multidisciplinary study of herbicide resistance in polyploid summer crop weeds in order to obtain information for a more responsible use of herbicides and new indications for the management. The research focused on two of the most troublesome weeds in summer crops: Echinochloa crus-galli (L.) Beauv. infesting maize and rice in northern Italy and Sorghum halepense (L.) Pers. infesting dicot crops in Italy and maize in Hungary. Both species have evolved resistance to two groups of selective herbicides, the acetil coenzyme A carboxylase (ACCase) inhibiting herbicides and the acetolactate synthase (ALS) inhibiting herbicides. This study may have two important impacts: at practical level because these two weeds are becoming a big problem in the management of infested crops, and at scientific level because very few studies have been done on polyploid species for the difficulty to work with. The project evolved during the three years, starting from the screening of the putative resistant populations of each species and the determination of the resistance patterns and levels through dose-response experiments. Twenty two E. crus-galli populations resistant to ALS inhibitors (thirteen sampled in maize and nine in rice fields) and five E. crus-galli populations multiple-resistant to ALS and ACCase inhibitors in rice crops were confirmed. Furthermore, ten S. halepense populations were confirmed to be resistant to ALS inhibitors in maize fields (nine in Hungary and one in Italy) and five to ACCase inhibitors in dicot crops. This means that resistance to ALS inhibitors in E. crus-galli is spreading rapidly in Italy and it is particularly worrying where multiple resistance to ALS and ACCase inhibitors is present. Resistance to sulfonylureas, an ALS inhibitors chemical family, in S. halepense is instead rapidly spreading in some Hungarian regions. Resistance indexes calculated for ALS inhibitors resulted very high for all populations, indicating that a target-site resistance mechanism may be involved. Subsequently, the experiments diverged for the two species. For E. crus-galli the focus was the molecular and physiological basis of ALS inhibitors resistance, through several in vitro experiments. The Southern blotting analysis clearly showed the presence of multiple copies of the ALS gene in the genome of E. crus-galli. ALS enzyme activity bioassay showed high resistance levels to both ALS inhibitors tested, confirming that an altered target site was responsible for conferring resistance to this group of herbicides. A long and tedious work, due to the polyploid nature of the species and the paucity of information in the literature, allowed to obtain the first ALS gene sequence of E. crus-galli, which was published in GenBank database. Specific primers were designed on that the sequence and two or three plants for each populations were analyzed through cloning and phylogenetic trees designed on clone sequences. This procedure permitted to identify two clusters that were associated to the expressed ALS genes (ALS1 and ALS2). The “strong” mutation Trp-574-Leu, one of the most documented mutation proved to endow resistance to ALS inhibitors in several weed species, was detected in all the samples belonging the resistant populations, and it was always found in ALS1. A molecular marker, called AS-CAPS (Allele Specific - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences), was designed and validated for the rapid detection of the mutation 574, in homozygous or heterozygous status, in a large number of samples. For S. halepense, geophyte which reproduces even by seed, growth analysis experiments were designed in order to study the biomass allocation in these two reproductive organs of different biotypes (susceptible, ACCase inhibitors resistant, and ALS inhibitors resistant). Furthermore, the molecular bases of the two different types of resistance were partially investigated. Previous molecular analyses confirmed that in all of the ACCase inhibitors resistant populations included in the experiments, a single amino acid substitution Ile-2041-Asn had occurred. Analyses with the molecular marker Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 2041 confirmed the presence of this allelic variant in all the plants belonging the resistant populations. The three growth analysis experiments indicated that the resistance status of S. halepense is associated with different patterns of dry matter partitioning, at least for the ACCase inhibitors resistant populations having the Ile-2041-Leu allelic variant: the resistant biotype showed a lower panicles production, as well as seeds, and a higher ratio of biomass allocated below ground, due to their higher production of rhizomes. No clear differences were observed between the susceptible and the ALS resistant biotypes, probably due to the different type of resistance involved, i.e. two different mutation were detected, Trp-574-Leu in one population and Asp-376-Glu in another. Results were consistent when the same starting material was used. In particular, 2009 and 2011 experiments, where plants grew from rhizome buds, showed very comparable results. Some differences were, instead, detected in the 2010 experiment, where plants grew from seeds. Results showed as the overall situation of E. crus-galli in Italian rice crops is of great concern, due to the scarcity of effective herbicides with different modes of action available. It is very important to prevent at least the evolution of multiple resistant biotypes. This can only be pursued through the implementation of resistance management strategies based on real integrated weed management approach.La resistenza agli erbicidi è un problema a livello mondiale e sta evolvendo velocemente anche in Italia, in particolare nelle zone dove monocoltura e scarsa rotazione di erbicidi con diverso meccanismo d’azione sono pratiche comuni. Inoltre, a causa dell’implementazione dei regolamenti a livello Europeo e dell’ampio utilizzo di gruppi di erbicidi con sito d’azione altamente specifico, sta diminuendo il numero di principi attivi a disposizione, aumentando così il rischio di insorgenza di nuovi casi di resistenza e rendendo più difficoltosa la loro gestione. La linea guida principale del mio progetto è lo studio multidisciplinare della resistenza agli erbicidi in infestanti poliploidi di colture estive, allo scopo di ottenere informazioni utili per un uso più responsabile degli erbicidi e nuove indicazioni per la gestione della resistenza. In particolare sono state caratterizzate due delle malerbe più problematiche nelle colture estive: Echinochloa crus-galli (L.) Beauv., infestante di mais e riso in Nord Italia, e Sorghum halepense (L.) Pers., infestante di colture dicotiledoni in Italia e di mais in Ungheria. Entrambe le specie hanno sviluppato resistenza a due classi di erbicidi selettivi: gli inibitori dell’acetil coenzima A carbossilasi (ACCasi) e quelli dell’acetolattato sintasi (ALS). Gli scopi di questo lavoro sono molteplici, a livello pratico in quanto queste due specie stanno diventando un grosso problema nella gestione delle colture infestate e a livello scientifico poiché, vista la difficoltà di lavorarci, sono stati fatti pochi studi su specie poliploidi. Il progetto è stato sviluppato nel corso dei tre anni, a partire dallo screening delle popolazioni presunte resistenti di ogni specie e la determinazione del pattern e dei livelli di resistenza attraverso degli esperimenti di dose-risposta. I risultati mettono in evidenza come la resistenza agli inibitori dell’ALS in E. crus-galli si stia diffondendo rapidamente: sono state confermate diverse popolazioni resistenti agli inibitori dell’ALS (tredici campionate in mais e nove in riso) e, per la prima volta in Europa, dei casi di multi-resistenza agli inibitori dell’ALS e dell’ACCasi (cinque in colture di riso). La situazione del S. halepense in Italia è abbastanza stabilizzata (le cinque popolazioni resistenti agli inibitori dell’ACCasi trovate in colture dicotiledoni risalgono al 2007), mentre la resistenza alle solfoniluree (una famiglia degli inibitori dell’ALS) si sta diffondendo rapidamente in alcune regioni dell’Ungheria, dove dieci popolazioni sono state confermate negli ultimi tre anni. Gli indici di resistenza calcolati per gli inibitori dell’ALS sono risultati molto elevati per tutte le popolazioni, indicando che potrebbe essere coinvolto un meccanismo di tipo target-site. Successivamente sono stati condotti esperimenti diversi per le due specie. Per quel che riguarda E. crus-galli lo studio si è concentrato sulle basi molecolari e fisiologiche della resistenza agli inibitori dell’ALS, attraverso una serie di esperimenti in vitro. Il Southern blotting ha chiaramente dimostrato la presenza di copie multiple del gene ALS nel genoma di E. crus-galli. Il saggio enzimatico che misura l’attività dell’ALS ha dato alti livelli di resistenza per entrambi gli inibitori dell’ALS testati, confermando che un sito target alterato è responsabile della resistenza a questo gruppo di erbicidi. Un lavoro lungo e difficile, a causa della natura poliploide della specie e della scarsità di informazioni in letteratura, ha permesso di ottenere per la prima volta la sequenza del gene ALS di E. crus-galli, che è stata pubblicata nel database GenBank. Su questa sequenza sono stati costruiti primers specifici e, attraverso degli esperimenti di clonaggio, sono state analizzate due o tre piante per ogni popolazione, per arrivare infine alla costruzione di alberi filogenetici utilizzando le sequenze dei cloni. Questa procedura ha permesso di identificare due clusters che sono stati associati a due copie espresse del gene ALS (ALS1 e ALS2). La mutazione forte Trp-574-Leu, una tra le mutazioni più documentate che inducono resistenza agli inibitori dell’ALS in diverse specie, è stata trovata in tutte le piante resistenti, e sempre nella copia del gene ALS1. E’ stato poi costruito e validato un marcatore molecolare, chiamato AS-CAPS (Allele Specific - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) per l’identificazione della mutazione 574, in omozigosi o in eterozigosi, in un ampio numero di campioni. Per quel che riguarda S. halepense, geofita che si riproduce anche per seme, sono state eseguite delle analisi di crescita con lo scopo di studiare l’allocazione della biomassa nei due organi riproduttivi di diversi biotipi (suscettibili, resistenti agli inibitori dell’ACCasi e resistenti agli inibitori dell’ALS). Inoltre, sono state parzialmente studiate le basi molecolari della resistenza dei due diversi gruppi di erbicidi. Analisi molecolari precedenti hanno confermato che in tutte le popolazioni resistenti agli inibitori dell’ACCasi incluse nell’esperimento era presente la mutazione Ile-2041-Asn. L'analisi dei campioni con il marcatore molecolare Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 2041 ha confermato la presenza di questa variante allelica in tutte le piante delle popolazioni resistenti. I tre esperimenti di analisi di crescita hanno indicato che la resistenza è associata a diversi pattern di allocazione della biomassa, almeno per quel che riguarda le popolazioni resistenti agli ACCasi che hanno la variante allelica Ile-2041-Asn: il biotipo resistente ha una produzione minore di pannocchie, e allo stesso tempo di semi, e una maggior percentuale di biomassa allocata sotto terra, dovuta alla maggior produzione di rizomi. Non sono state invece osservate chiare differenze fra il biotipo resistente agli inibitori dell’ALS e quello suscettibile, probabilmente a causa del diverso tipo di resistenza coinvolto: infatti sono state trovate due diverse mutazioni, la Trp-574-Leu in una popolazione e la Asp-376-Glu in un’altra. I risultati si sono dimostrati coerenti quando è stato utilizzato lo stesso materiale di partenza. In particolare, gli esperimenti del 2009 e del 2011, dove sono state utilizzate piante cresciute da rizoma, hanno dato risultati molto simili. Invece alcune differenze sono state registrate nell’esperimento del 2010, dove le piante utilizzate sono cresciute da seme. I risultati mostrano come la situazione di E. crus-galli in coltivazioni di riso sia particolarmente preoccupante, a causa della scarsità di erbicidi efficaci con diversi modi d’azione. Quindi è molto importante prevenire almeno l’evoluzione di biotipi multi-resistenti. Questo può essere ottenuto solamente attraverso l’implementazione delle strategie di gestione della resistenza basate su un reale approccio di gestione integrata delle malerbe