CHANGES IN MITOCHONDRIAL CRISTAE STRUCTURE DETERMINE CELL VIABILITY IN MODELS OF HUNTINGTON'S DISEASE

Mitochondria are essential organelles for the life of the cells since they are the major source of cellular ATP (Danial et al., 2003), they regulate Ca2+ signalling (Rizzuto et al., 2000) and programmed cell death (Green and Kroemer, 2004). Mitochondria amplify the intrinsic apoptotic pathway by releasing protein cofactors, like cytochrome c, that are crucial for the activation of effector caspases required for cell demise. The majority of cytochrome c and the other components of the respiratory chain are restricted in the cristae compartment. Thanks to the development of 3D electron microscopy techniques, it has been demonstrated that cristae are not just invagination of the inner mitochondrial membrane as previously depicted by Palade in 1952, but distinct compartments of it, separated from the intermembrane space by narrow tubular cristae junctions (Mannella et al., 1994). During apoptosis, to reach a complete release of cytochrome c mitochondria undergo ultrastructural changes collectively called cristae remodelling characterized by the fusion of individual cristae and the widening of tubular narrow cristae junctions (Scorrano et al., 2002). The ultrastructural remodeling is accompanied by changes in the shape of mitochondrial network that undergoes massive fragmentation. The shape of mitochondria is determined by the equilibrium between fusion and fission processes, controlled by a family of mitochondria-shaping proteins, many of which are dynamin-related GTPases. In mammalian cells, mitochondrial fusion depends on mitofusin 1 and 2 in the outer mitochondrial membrane and on the inner membrane protein optic atrophy 1 (OPA1) (Olichon et al., 2002). In our laboratory it has been demonstrated that OPA1 requires mitofusin 1 in order to promote mitochondrial fusion (Cipolat et al., 2004). Fission requires the additional step of translocation of dynamin-related protein 1 (Drp1) from the cytosol to mitochondria where it presumably docks on hFis1, its adaptor in the outer membrane. Oligomerization of Drp1 is believed to provide the mechanical force to constrict mitochondrial membranes and to fragment the organelle (Hinshaw et al,, 1999; Smirnova et al, 2001). Translocation of Drp1 to mitochondria depends on its dephosphorylation by calcineurin and other phosphatases (Cereghetti et al., 2008). A growing body of evidence suggests that mitochondria shaping proteins participate in cell death. In our laboratory it has been recently demonstrated that OPA1 protects from apoptosis by preventing cytochrome c release independently of mitochondrial fusion. OPA1 keeps in check the cristae remodelling pathway and tightness of cristae junctions correlates with oligomerization of two forms of OPA1, a soluble intermembrane space and an integral inner membrane one (Frezza et al., 2006; Cipolat et al., 2006). Moreover, other works showed that the expression of a dominant negative mutant of Drp1, with disrupted enzymatic activity, prevents mitochondrial fragmentation, cytochrome c release and cell death induced by intrinsic apoptotic stimuli (Frank et al., 2001). Interestingly, Drp1 seems to specifically regulate the release of cytochrome c, suggesting that the mitochondrial subcompartmentalization of the pro-apoptotic factor can be altered by Drp1 (Parone et al., 2006). The aim of my thesis has been to study the role of calcineurin-dependent mitochondrial fission in cell death and in the pathogenesis of Huntington's Disease. Recently our laboratory demonstrated that mitochondrial depolarization triggers activation of the cytosolic phosphatase calcineurin. Calcineurin dephosphorylates Drp1 on Ser637, stimulating its translocation to mitochondria, and ultimately leading to the fragmentation of the organelle (Cereghetti et al., 2008). To further characterize the importance of this pathway in apoptosis we focused on a new specific inhibitor of calcineurin, a peptide, PPD1, corresponding to the peptidylproplyl isomerase domain of immunophilin FK506 binding protein 52. Besides being genetically encoded and therefore more stable than small pharmacological inhibitors, PPD1 doesn't affect the interaction of Drp1 with the dynein motor complex, also implied in the translocation of Drp1 to mitochondria, as we showed by co-immunoprecipitation experiments. Time course confocal microscopy analysis of HeLa cells transfected with a red fluorescent protein targeted to mitochondrial matrix (mtRFP) showed that expression of PPD1 strongly delays mitochondrial fragmentation induced by mitochondrial depolarization. This effect can be ascribed to the observed reduction of Drp1 translocation to mitochondria. We then wanted to check whether PPD1-dependent inhibition of fragmentation could interfere with apoptosis. To this aim, we analyzed the kinetics of cell death induced by a panoply of intrinsic apoptotic stimuli. The overexpression of PPD1 could protect from apoptosis induced by staurosporine, hydrogen peroxide, etoposide and thapsigargin. Moreover, the cytoprotective effect of PPD1 was strongly confirmed by a clonogenic assay in which cells expressing PPD1 showed higher ability in surviving and generating new colonies despite the treatment with staurosporine. To understand whether PPD1 could affect the release of cytochrome c we overexpressed mtRFP as marker of the mitochondrial network and then we immunodecorated cytochrome c with a FITC-conjugated secondary antibody. Overexpression of PPD1 prevented cytochrome c release in response to staurosporine. We then wished to ascertain whether PPD1 inhibits apoptosis by blocking the DRP1 pathway. To exclude the possibility that the observed protection exerted by PPD1 was due to the inhibition of dephosphorylation of other calciuneurin substrates involved in apoptosis, like the Bcl-family protein BAD, we turned to a genetic approach. We analyzed the effect of PPD1 on apoptosis in wt and Bad-/- mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Our expreriments demonstrated that BAD is dispensable for the antiapoptotic action of PPD1, since the overexpression of the peptide could protect Bad-/- MEFs from cell death induced by staurosporine. Moreover, the co-expression of PPD1 and a dominant negative mutant of Drp1 (DRP1K38A) did not protect more, suggesting that they act via the same pathway. These data further support the decisive role of mitochondrial fission and the cellular cues that regulate mitochondrial shape in apoptosis (Cereghetti, Costa et al., in revision, Cell Death and Differentiation). Increasing evidence show that in pathological conditions characterized by increased apoptosis, as in neurodegenerative diseases, mitochondria display changes in shape and ultrastructure. In particular, our attention was caught by electron microscopy images of mitochondria from lymphoblasts from Huntington's Disease patients that showed deep ultrastructural alterations strongly resembling cristae remodelling. Huntington's disease is a dominant genetic neurodegenerative disorder caused by the polyglutamine expansion in the huntingtin protein. The disease is characterized by specific loss of medium spiny neurons in the striatum, resulting in motor and cognitive symptoms. We therefore decided to characterize the mitochondrial morphological alterations and their effect on cell death in two different models of Huntington's Disease: immortalized lymphoblasts from patients and striatal neuronal precursors from knock-in mouse models bearing a polyglutamine expansion in the endogenous huntingtin gene. Confocal imaging analysis of mitochondrially targeted yellow fluorescent protein (mtYFP) revealed that HD cells display fragmented mitochondrial network if compared with the relative controls. Notably, the fragmentation was more severe in homozygous than in heterozygous patients, supporting a phenotype-genotype correlation. We then checked whether the morphological phenotype could be ascribed to alterations in levels of mitochondria-shaping proteins. Despite no differences in their total levels, more Drp1 was retrieved on mitochondria isolated from HD cells than in wt. Moreover, crosslinking experiments revealed that Drp1 was more oligomerized in HD cells. These data suggested that an over-activation of the fission machinery could account for the observed fragmentation. Interestingly, OPA1 isoforms pattern at steady state and their processing upon staurosporine treatment was altered in HD cells, indicating a possible molecular mechanism through which Drp1 could regulate cristae morphology. We then decided to check whether we could correct the morphological phenotype either promoting mitochondrial fusion or inhibiting the mitochondrial fission machinery. To this aim, we co-transfected our cell lines with mtYFP and empty vector or OPA1, MFN1, DRP1K38A and a dominant negative mutant of calcineurin. We observed that both the overexpression of pro-fusion proteins and the inhibition of the fragmentation pathway could correct the mitochondrial shape alterations. The following step was to understand which was the functional meaning of the observed morphological defects and whether they could influence apoptosis. Flow cytometric analysis of cell death of lymphoblasts revealed that cells from HD patients are more susceptible to staurosporine. The same was confirmed in neurons from HD mice, which show increased poly ADP-ribose polymerase (PARP) cleavage, an hallmark of apoptosis. Interestingly, the overexpression of OPA1 and DRP1K38A or the treatment with the calcineurin inhibitor FK506 restored the apoptotic susceptibility of HD cells to wt levels. However, the overexpression of MFN1 did not confer protection towards cell death, meaning that fusion per se is not sufficient for counteracting apoptotic stimuli. The analysis of the kinetic of cytochrome c release from isolated mitochondria upon treatment with the apoptotic stimulus cBID, using a specific ELISA assay, showed that HD organelles release cytochrome c faster than the relative control. Moreover, crosslinking experiments demonstrated that the enhanced release of cytochrome c correlates with a faster disruption of OPA1 oligomers. The increased cristae remodelling process in HD mitochondria was further confirmed by electron microscopy imaging of mitochondrial ultrastructure upon treatment with staurosporine. HD cells showed decreased number of cristae per mitochondrion at steady state and the cristae compartment became highly deranged and reorganized following the apoptotic stimulus. Importantly, overexpression of OPA1 and DRP1K38A could clearly increase the number of properly structured cristae and inhibit their reorganization during apoptosis. In conclusion, the data presented in this doctoral thesis show that the calcineurin-DRP1 axis-dependent regulation of mitochondrial fragmentation plays a crucial role in the progression of the intrinsic apoptotic cascade. Furthermore, we could demonstrate that this pathway is altered in Huntington's disease and could account for the increased cell death that characterizes this neurodegenerative disorder (Costa et al., submitted, EMBO Mol. Med.).I mitocondri sono organelli esseziali nella vita della cellula: essi rappresentano la maggiore fonte di ATP (Danial et al., 2003) e regolano importanti vie di trasduzione del segnale, dall'omeostasi del Ca2+ (Rizzuto et al., 2000) all'apoptosi. In seguito ad uno stimolo apoptotico i mitocondri rilasciano citocromo c e altre proteine solubili nello spazio intermembrana che sono necessarie, nel citoplasma, per l'attivazione e l'amplificazione della cascata del segnale che porta al disassemblamento della cellula. La maggior parte del citocromo c e dei componenti della fosforilazione ossidativa sono localizzati all'interno delle cristae. Grazie ai notevoli sviluppi della microscopia elettronica associata a ricostruzione tridimensionale il modello di ultrastruttura dei mitocondri è stato recentemente rivoluzionato; le cristae, dapprima identificate come semplici invaginazioni della membrana mitocondriale interna (IMM) (Palade, 1952), risultano essere compartimenti distinti di IMM, separati dallo spazio intermembrana da giunzioni tubulari strette definite cristae junctions (Mannella et al., 1994). Durante l'apoptosi, per garantire un completo rilascio di citocromo c le singole cristae si fondono tra loro e le giunzioni tubulari strette si allargano: questo processo, noto con il nome di cristae remodelling, è associato alla mobilizzazione del citocromo c dal compartimento intracristale allo spazio intermembrana, evento necessario per il suo successivo rilascio attraverso la membrana mitocondriale esterna (Scorrano et al., 2002). Il rimodellamento ultrastrutturale è accompagnato da una massiva frammentazione del reticolo mitocondriale. La forma del reticolo mitocondriale è determinata dall'equilibrio tra eventi di fusione e fissione, controllati da numerose proteine tra cui le GTPasi simili a dinamine. In cellule di mammifero, la fusione mitocondriale è controllata dalle proteine mitofusina-1 (MFN1) e mitofusina-2 (MFN2) nella membrana esterna e da OPA1 nella membrana mitocondriale interna (Olichon et al., 2002). Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che OPA1 promuove la fusione dei mitocondri solo in presenza di mitofusina 1 (Cipolat et al., 2004). La fissione richiede il passaggio aggiuntivo della traslocazione della proteina Drp1 dal citosol ai mitocondri, dove si ancora a hFis1, il suo adattatore molecolare nella OMM. L'oligomerizzazione di Drp1 fornisce la forza meccanica per costringere le membrane mitocondriali fino alla frammentazione dellâorganello (Hinshaw et al., 1999; Smirnova et al., 2001). La traslocazione di Drp1 ai mitocondri dipende dalla sua defosforilazione ad opera della fosfatasi calcineurina e di altre fosfatasi (Cereghetti et al., 2008). Un crescente numero di evidenze sperimentali suggerisce che le proteine che regolano la morfologia dei mitocondri giochino un ruolo nella morte cellulare. Nel nostro laboratorio è stato recentemente dimostrato che OPA1 protegge dall'apoptosi prevenendo il rilascio di citocromo c in maniera indipendente dal suo ruolo profusogeno. OPA1 agisce controllando il processo di rimodellamento delle cristae e mantiene strette le giunzioni delle cristae attraverso la formazione di oligomeri, costituiti da una forma solubile localizzata nello spazio intermembrana e una forma integrale della IMM (Frezza et al., 2006; Cipolat et al., 2006). Inoltre, numerosi lavori hanno dimostrato che l'espressione di un mutante dominante negativo di Drp1 è in grado di prevenire la frammentazione mitocondriale, il rilascio di citocromo c e la morte cellulare indotti da stimoli apoptotici intrinseci (Frank et al., 2001). E'interessante notare che Drp1 sembra regolare in modo specifico il rilascio di citocromo c suggerendo una sua capacità di regolare la sub compartimentalizzazione mitocondriale di questo fattore pro-apoptotico (Parone et al., 2006). Lo scopo della mia tesi è stato quello di studiare il ruolo della frammentazione mitocondriale regolata da calcineurina nella morte cellulare e nella patogenesi della Corea di Huntington. Recentemente, nel nostro laboratorio è stato dimostrato che la depolarizzazione mitocondriale causa l'attivazione della fosfatasi citosolica calcineurina. Calcineurina defosforila Drp1 in corrispondenza del residuo di serina 637, stimolandone la traslocazione ai mitocondri e causando la frammentazione degli organelli (Cereghetti et al., 2008). Allo scopo di caratterizzare l'importanza di questa via del segnale nell'apoptosi abbiamo focalizzato la nostra attenzione su un nuovo specifico inibitore di calcineurina: il peptide PPD1, che corrisponde al dominio peptidilprolil isomerasico della immunofillina FKBP52. PPD1 è codificato geneticamente e quindi risulta essere più stabile degli inibitori farmacologici. Attraverso esperimenti di immunoprecipitazione, abbiamo dimostrato che PPD1 non influenza l'interazione di Drp1 con il complesso motore contenente la dineina, anch'esso coinvolto nella traslocazione di Drp1 ai mitocondri. Un'analisi cinetica tramite microscopia confocale di cellule esprimenti una variante spettrale della green fluorescent protein, la red fluorescent protein (mtRFP), specificatamente diretta alla matrice mitocondriale, ci ha permesso di verificare che l'espressione di PPD1 inibisce fortemente la frammentazione del reticolo indotta da depolarizzazione mitocondriale. Questo effetto può essere attribuito alla riduzione di traslocazione di Drp1 ai mitocondri. Abbiamo poi voluto controllare se l'inibizione della frammentazione esercitata da PPD1 potesse interferire con l'apoptosi. A questo scopo abbiamo analizzato la cinetica della morte cellulare indotta da stimoli apoptotici intrinseci. L'analisi ha rivelato che l'espressione di PPD1 è in grado di proteggere dalla morte cellulare indotta da staurosporina, perossido di idrogeno, etoposide e tapsigargina. Inoltre, un saggio clonogenico ha confermato l'effetto protettivo di PPD1, poichè cellule esprimenti il peptide hanno dimostrato un'aumentata capacità di formare colonie dopo il trattamento con staurosporina. Per capire se PPD1 potesse influenzare il rilascio di citocromo c abbiamo espresso la proteina mtRFP come marker mitocondriale e abbiamo immunodecorato il citocromo c con un anticorpo coniugato ad un fluoroforo verde (FITC). L'overespressione di PPD1 è in grado di prevenire il rilascio di citocromo c in risposta alla staurosporina. Abbiamo poi voluto accertare se l'inibizione dell'apoptosi da parte di PPD1 dipendesse in modo specifico dalla sua azione sulla proteina Drp1. A questo scopo èstato necessario escludere che l'effetto di PPD1 fosse dovuto all'inibizione della fosforilazione di altri substrati di calcineurina coinvolti nell'apoptosi, come il membro della famiglia di proteine Bcl2 BAD. Ci siamo quindi avvalsi di un approccio genetico andando ad analizzare l'effetto di PPD1 sulla morte cellulare in fibroblasti murini embrionali wt e ko per BAD. I nostri esperimenti hanno dimostrato che BAD non è necessaria per l'effetto anitapoptotico di PPD1, poichè il peptide protegge dalla morte cellulare anche cellule BAD ko. Inoltre, la co-espressione di PPD1 e un mutante dominante negativo di DRP1 (DRP1K38A) non risulta in un effetto di protezione aggiuntivo, indicando che le due proteine agiscono nella stessa via di trasduzione del segnale. Questi dati rappresentano un'ulteriore conferma del ruolo decisivo giocato dalla frammentazione mitocondriale e dai modulatori della morfologia mitocondriale nell'apoptosi (Cereghetti, Costa et al., in revisione, Cell Death and Differentiation). Un crescente numero di studi dimostra che in condizioni patologiche caratterizzate da aumentata apoptosi, come nelle patologie neurodegenerative, i mitocondri presentano alterazioni della morfologia del reticolo e della loro ultrastruttura. In particolare, analisi di microscopia elettronica di linfoblasti da pazienti affetti da Corea di Huntington hanno evidenziato mitocondri con profonde alterazioni ultrastrutturali comparabili a quelle osservate durante il processo di rimodellamento dell cristae. La Corea di Huntington è una patologia neurodegenerativa genetica causata dalla anomala espansione di un dominio poliglutamminico nella proteina Huntingtin. La principale caratteristica clinica della patologia è la perdita selettiva di neuroni GABA-ergici dello striatum che causa l'insorgenza di disturbi motori e cognitivi. Abbiamo deciso di caratterizzare le alterazioni morfologiche dei mitocondri e il loro effetto sulla morte cellulare in due diversi modelli della malattia: linfoblasti immortalizzati isolati da pazienti e precursori di neuroni striatali derivati da un modello murino transgenico avente una espansione delle ripetizioni CAG nel gene endogeno per la proteina huntingtin. L'analisi tramite microscopia confocale di cellule trasfettate con una proteina fluorescente gialla diretta ai mitocondri (mtYFP) ha rivelato che le cellule aventi la mutazione presentavano un reticolo mitocondriale frammentato se paragonate alle relative cellule di controllo.E' importante notare che la frammentazione è risultata essere più evidente in linfoblasti da pazienti omozigoti che da eterozigoti indicando una correlazione tra la severità del fenotipo e il genotipo. Abbiamo poi controllato se il fenotipo morfologico potesse essere causato da alterazioni nei livelli delle proteine che controllano la forma dei mitocondri. I nostri esperimenti non hanno rivelato differenze nei livelli di espressione, ma abbiamo osservato che la proteina Drp1 era maggiormente associata ai mitocondri isolati da cellule di Huntington che dalle wt. Inoltre, esperimenti di crosslinking hanno evidenziato una aumentata oligomerizzazione di Drp1 nelle cellule aventi la mutazione. Questi dati hanno suggerito che l'eccessiva attivazione dell'apparato di fissione potesse essere la causa della frammentazione osservata. Abbiamo inoltre riscontrato alterazioni nella abbondanza relativa delle isoforme di OPA1 allo stato stazionario e del loro processamento in risposta a trattamento con staurosporina. Questo dato spinge ad ipotizzare un potenziale meccanismo molecolare attraverso il quale Drp1 possa regolare la struttura delle cristae. Abbiamo poi cercato di correggere il fenotipo morfologico promuovendo la fusione o inibendo la fissione dei mitocondri. L'overespressione di proteine profusogene OPA1 e MFN1 e di mutanti dominanti negativi di Drp1 e di calcineurina è risultata nella correzione del difetto morfologico. Il passo successivo è stato quello di indagare il significato funzionale delle alterazioni osservate, in particolare nella morte cellulare. Analisi tramite citofluorimetria condotta sui linfoblasti ha evidenziato una aumentata sensibilità alla morte