Transcriptional responses and AMP transcript diversity in M. galloprovincialis

The present dissertation contains the work done during my PhD in Biotechnology (2009-2011) and, through three published articles, shows how the research group which I worked in has contributed to the development of functional genomics in the mollusc bivalve Mytilus galloprovincialis. Using different approaches, we aimed to better understand the peculiarities of a transcriptome only partially investigated, focusing our attention on molecules possibly explaining the mussel innate immunity, defense system that allows the survival of this organism in potentially lethal habitats. Starting from a publicly available collection of expressed sequence tags (ESTs) generated from various tissues of native mussels or from mussels subjected to various stress conditions, we have analyzed and described relevant transcript groups and singletons involved in the mussel immune responses. A selection of these sequences has been used to design a new DNA-microarray platform (Immunochip 1.0), a new tool for the experimental validation of the many gene transcripts possibly playing a role in the sensing, signaling and effector functions of the mussel innate immunity (Venier et al., 2011). DNA microarray platforms are widely used to investigate the expression of thousands of transcripts and, in general, they provide reliable and dynamic measures of transcriptional trends. As far as the genus Mytilus, species-specific platforms and also platforms including probes of evolutionary close species are available (Domeneghetti et al., 2011). Using an advanced sequencing approach, we have finally explored and mapped the transcriptional diversity of nine typical antimicrobial peptides expressed in mussels (defensins, mytilins, myticins and mytimycin): although different one from the other, a high frequency of single nucleotide changes was globally evident (Rosani et al., 2011). These results pave the way to study genetic and epigenetic mechanisms able to explain the observed transcript diversity, yet undetermined in mussel, and to characterize, from a functional point of view, sequence variants expressed in response to different antigenic stimuliLa presente tesi raccoglie il lavoro svolto durante il mio dottorato in biotecnologie (2009-2011) e, tramite tre articoli pubblicati, mostra come il gruppo di ricerca entro il quale mi sono inserito ha contribuito ad ampliare le conoscenze nel campo della genomica funzionale del mollusco bivalve Mytilus galloprovincialis. Utilizzando differenti approcci abbiamo cercato di comprendere aspetti di un trascrittoma solo parzialmente conosciuto, soffermandoci sulle molecole dell'immunità innata, sistema difensivo grazie al quale questo organismo invertebrato sopravvive in ambienti ricchi di patogeni. Avendo a disposizione una collezione di sequenze espresse (EST) rappresentativa di vari tessuti di mitili nativi e di mitili sottoposti a varie condizioni di stress, abbiamo analizzato e descritto alcuni importanti singole sequenze e gruppi di trascritti coinvolti nelle risposte immuni del comune mitilo mediterraneo. Una selezione di questi è stata utilizzata per disegnare una piattaforma DNA-microarray (Immunochip 1.0) utile a validare sperimentalmente la grande varietà di trascritti genici potenzialmente implicati nel sensing, nel signalling e in funzioni effettrici dell’immunità innata di M. galloprovincialis (Venier et al., 2011). Le piattaforme DNA microarray sono ormai largamente utilizzate per lo studio in parallello dell'espressione di migliaia di trascritti e, in generale, forniscono misure affidabili e dinamiche degli andamenti trascrizionali. Riguardo al genere Mytilus, sono state sviluppate piattaforme specie-specifiche e piattaforme ibride che includono sonde nucleotidiche di specie evolutivamente affini (Domeneghetti et al., 2011). Utilizzando un approccio di sequenziamento avanzato, abbiamo infine esplorato e mappato la diversità trascrizionale di nove tipici peptidi antimicrobici espressi in mitilo (varie defensine, mitiline, miticine e mitimicina) scoprendo così, pur con differenze da caso a caso, una elevata frequenza di cambiamenti a singolo nucleotide (Rosani et al., 2011). Sulla base di questi risultati sarà interessante studiare meccanismi genetici ed epigenetici che possano spiegare tale variabilità di sequenza, ancora indeterminati in mitilo, e caratterizzare da un punto di vista funzionale le varianti espresse in risposta a diversi stimoli antigenic