Structure and Function of Coagulation Factors in Health and Disease. Thrombin, beta2-Glycoprotein I and von Willebrand factor

Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of death globally. According to the World Health Organization (WHO), it was responsible for 30% of all deaths in 2005 with respect, for instance, to cancer related diseases that cover only the 10-15%. Unfortunately this scenario is dramatically evolving year after year, not only in the high-income countries where risk factors such as smoking, diet and pollution are elevated but also in some developing nations where the wellness and industrialisation are changing the lifestyle and the mores of the people. Cardiovascular disease usually stems from vascular dysfunction or heart failure which can be the result of atherosclerosis, thrombosis, high blood pressure, angina pectoris and congenital cardiovascular defects. Generally the cardiovascular disease is a long term treated disease that during time compromises not only the single district where the injury takes place but the overall organism leading to death. Among all cardiovascular diseases, thrombosis — localized pathological clotting of the blood — can occur in the arterial or the venous circulation and has a major medical impact. Acute arterial thrombosis is the proximal cause of most cases of myocardial infarction (heart attack) and of about 80% of strokes, collectively the most common cause of death in the developed world. Venous thromboembolism is the third leading cause of cardiovascular-associated death. A great complication regarding the study of the CVD is the multiplicity and the heterogeneous system that has to be consider. For instance the pathophysiology of arterial thrombosis totally differs from that of venous thrombosis, as reflected by the different ways in which they are treated. In broad terms, arterial thrombosis is treated with drugs that target platelets, and venous thrombosis is treated with drugs that target proteins of the coagulation cascade. The available antithrombotic drugs are effective at reducing arterial thrombosis and venous thrombosis in patients with cardiovascular disease. However, the main side effect of these drugs is bleeding, which limits their use. To develop a new generation of safe and effective antithrombotic drugs with larger therapeutic windows (that is, a larger difference between the dose that prevents thrombosis and the dose that induces bleeding), a better understanding of the pathogenic processes that lead to thrombotic occlusion of blood vessels is needed. During my Ph.D. course my efforts have been devoted to investigate specific aspects of the structure and function of blood coagulation factors and their inhibitors (i.e., thrombin, hirudin, haemadin, protease nexin-1, beta2-glycoprotein-I, ADAMTS-13 protease and von Willebrand factor) using chemical (solid-phase peptide synthesis, mass spectrometry), biochemical (enzyme kinetics) and biophysical (fluorescence, circular dichroism, surface plasmon resonance, calorimetry) techniques. Herein reported in my Ph.D. Thesis, the different treated subjects are divided into independent chapters each containing a single case study. Briefly in chapter 2 it has been proposed the study on the structure and function of thrombin, a serine protease that exerts a pivotal role in blood coagulation. In particular it was investigated the allosteric nature of thrombin and information obtained about the enzyme was further applied to propose a rational model to finally design new possible antiaggregant and anticoagulant agents. In chapter 3 it has been reported the study on the β2-Glycoprotein I (β2GpI), a plasma glycoprotein that has been recently recognized as the primary target for some autoantibodies (aPL) found in the autophospholipid syndrome (APS). In this study we contributed to identify a conformational epitope, corresponding to the first domain of the full-length protein, that was efficiently recognized by the plasma autoantibodies of the patients. Starting form these considerations we further propose a new therapeutic and diagnostic approach for the antiphospholipid syndrome. Finally in chapter 4, it has been reported a study concerning the effect of the oxidation mediated by peroxynitrite on von Willebrand factor. Von Willebrand factor is a plasma glycoprotein extremely complex whose dimensions play a pivotal role in maintaining haemostasis. Since peroxynitrite oxidizes a single residue of methionine in the A2 domain of VWF, protease ADAMTS-13 results unable to process the full-length VWF leading to a multimer accumulation and consequently to a prothrombotic event. Notably this mechanism has been demonstrated in vitro and, more interestingly, in patients possessing an elevated oxidative stress conditions, such as diabetes mellitus type 2.Oggigiorno le malattie cardiovascolari rappresentano la principale causa di morte nel mondo. Secondo i dati riportati dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), il 30% di tutti i decessi è dovuto alle malattie cardiovascolari, mentre solamente il 10-15% è dovuto alle malattie oncologiche. Tale percentuale assume maggiore rilevanza se si considera che il numero di decessi è in aumento anno dopo anno, non solo nei paesi industrializzati ad elevato reddito ma anche nei paesi in via di sviluppo dove il benessere sta lentamente alterando le abitudini alimentari e sociali dei popoli. Il termine malattie cardiovascolari rappresenta un’ampia serie di patologie che, in modo generico, si possono ricondurre ad una disfunzione vascolare o cardiaca, quale ad esempio aterosclerosi, trombosi, ipertensione arteriosa, angina pectoris e malattie cardiache congenite. Molto spesso le malattie cardiovascolari hanno un decorso molto lungo e nel tempo invalidano gravemente la funzione non solo del distretto anatomico coinvolto, ma di tutto l’organismo. Nell’ambito delle malattie cardiovascolari, la trombosi — ovvero un fenomeno patologico spontaneo che porta alla coagulazione del sangue —rappresenta in assoluto la prima causa di morte. La trombosi arteriosa improvvisa è di fatto la principale causa di disfunzione e di infarto del miocardio, mentre il tromboembolismo venoso è la terza causa di morte. Un’importante complicazione che riguarda lo studio delle malattie cardiovascolari consiste nella diversa morfologia ed eziogenesi dei fenomeni di trombosi arteriosa e/o venosa. Tale diversità si riflette anche sul tipo di terapia utilizzata nella pratica clinica in cui i trombi arteriosi vengono preferenzialmente trattati con antiaggreganti piastrinici mentre quelli venosi, di norma, vengono trattati con farmaci anticoagulanti. Tuttavia, molto spesso, il decorso clinico dei pazienti genera un quadro terapeutico molto più complesso in cui le strategie utilizzate devono seguire percorsi integrati e trasversali. I farmaci ad ora utilizzati, pur essendo molto efficaci nel ridurre gli episodi di trombosi nei pazienti con malattie cardiovascolari, sono limitati nel loro impiego terapeutico poiché portano frequentemente ad episodi emorragici fatali. Per ridurre l’incidenza di tale effetto collaterale e migliore pertanto la loro finestra terapeutica è necessario studiare nei dettagli l’eziogenesi di tali patologie e quindi ottenere nuovi e più efficaci strumenti terapeutici e/o di prevenzione. Durante il mio dottorato di ricerca la mia attenzione è stata focalizzata sullo studio della struttura e della funzione di alcuni fattori della coagulazione e di loro inibitori (i.e., trombina, irudina, emadina, nexina 1, beta2-glicoproteina I, ADAMTS-13 e fattore di von Willebrand), utilizzando metodi chimici (sintesi di peptidi in fase solida, spettrometria di massa), biochimici (cinetica enzimatica e ELISA) e biofisici (fluorescenza, dicroismo circolare e SPR). In particolare in questa Tesi di Dottorato gli argomenti di studio sono stati trattati singolarmente, distinguendo i lavori in capitoli indipendenti. Brevemente nel capitolo 2 è stato indagato il rapporto struttura-funzione della trombina, una proteasi serinica cruciale nella cascata emocoagulativa, considerando dapprima la sua natura allosterica e quindi sfruttando le informazioni ottenute come base per lo sviluppo di nuovi possibili farmaci anticoagulanti ed antiaggreganti piastrinici. Nel capitolo 3, l’attenzione è stata trasferita alla β2-glicoptoteina I (β2GpI), una glicoproteina plasmatica che è stata recentemente identificata come il principale target di autoanticorpi coinvolti nella sindrome antifosfolipidica (APS). Lo studio della β2GpI ha contribuito ad individuare un dominio della proteina quale epitopo conformazionale riconosciuto dagli autoanticorpi, evidenziando così la possibilità di nuovi approcci terapeutici e diagnostici nella sindrome antifosfolipidica. Infine, nel capitolo 4, è stato riportato uno studio sull’effetto dell’ossidazione mediata da perossinitrito a carico del fattore di von Willebrand (VWF). Il fattore di von Willebrand è una glicoproteina plasmatica estremamente complessa le cui dimensioni contribuiscono a regolare l’equilibrio emostatico. Nello studio di seguito riportato è stato proposto e dimostrato come l’ossidazione di un residuo di metionina situato nel dominio A2 della glicoproteina impedisca il taglio proteolitico da parte di ADAMTS-13, promuovendo uno stato protrombotico nei pazienti sottoposti ad un elevato stress ossidativo