Horse heart study: left ventricular cardiomyocytes isolation, histidine-rich Ca2+ - binding protein and myostation espression

SUMMARY The horse has always been considered as a sport champion in the animal world. Horse athletic ability depends of many factors. The most important are cardiovascular system and heart physiology. It is noteworthy that horse heart rate is slow at rest (25-40 bmp) but can elevate rapidly during exercise to over 240 beats per minutes. In addition, horse heart is characterized by an higher cardiac action potential duration (APD) (0.6-1s) compared to that of other mammals (0.2-0.35s). Significantly differences in frequency, amplitude and calcium wave velocity have also been observed. These extraordinary features of the horse heart could be explained by some hypothesis: it may be a result of high calcium loading capacity of sarcoplasmic reticulum of horse cardiomyocytes or altered quantity/function of calcium bindings proteins that participate in excitation contraction coupling cycle of cardiac cell (Loughrey et al. 2004). These special characteristics of horse heart put my attention to two proteins, histidine-rich Ca2+-binding protein and myostatin. Histidine-rich Ca2+-binding protein (HRC) is one of the best candidates to regulate reticulum calcium sequestration and cardiac function. While myostatin is member of the transforming growth factor- superfamily, shown to be regulated during different physiological and pathological situations which affect cardiac muscle mass, including cardiac growth modulation (McKoy G et al. 2007), athletic hypertrophy (Matsakas A et al. 2006), postmyocardial infarction remodeling process, infarction-associated inflammation (MacLellan et al., 1993, Sharma M et al. 1999), fibrosis of the myocardium, and cardiac dysfunction (Hoenig MR, 2008). HRC has a similar protein structure and function to calsequestrin in skeletal muscle and seems to play the particular role in the heart. This low affinity and high capacity Ca2+ binding protein has a Ca2+ storage role in cardiac SR during EC-coupling (Gregory et al. 2006). Due to its important role as regulator of Ca release and normal cardiac function, recently HRC has been suggested to be an additional component of SR protein quaternary molecular complex (Lee H et al. 2001), associating into a stable complex at the junctional membrane: the Ryanodine channel, calsequestrin and its putative “anchoring” proteins triadin and junctin. HRC could be a key protein that manipulates the facilitation of Ca2+ release from SR through protein-protein interaction. In this work we hypothesed that the particular characteristic of the horse heart and long APD could be explained by HRC alteration in equine horse heart. On the other hand understanding of the MSTN pathway could have an important approach into veterinary clinical practice used during horse training when athletic hypertrophy is a common phenomenon. To achieve objective of this work we have used Real-time PCR and Standard PCR to investigate in details the expression of HRC and myostatin in various compartments of horse heart. We also compared the HRC mRNA expression of horse heart vs that of bovine. In order to gain insight protein level expression of HRC in horse heart, electrophoretic gel analysis were performed on membrane fractions extracted from horse cardiac muscle followed by Western blotting. Besides of immunofluorescence experiments on longitudinal cryosections from left ventricle have been carried out to study the cellular localization of HRC in horse heart. Our findings showed that HRC mRNA is mainly expressed in ventricles. Moreover, by comparison with another species of veterinarian interest, such as cattle, Real Time PCR data showed that the enhanced expression of HRC seems restricted to equine species. The dissimilar HRC mRNA expression in atria and ventricles may be due to the intrinsic features of heart parts, that could be emphasize by the special equine action potential duration. On account of the special features exhibited by horse cardiac tissue, taken together my data showing the overexpression of HRC in ventricular chambers, could strengthen the hypothesis of HRC as a candidate regulator of SR Ca2+ cycling during ECC. The interesting results revealed the upregulation of MSTN gene expression detected in left ventricular of horse heart could be an interesting data in favor to this hypothesis since the left ventricular chamber has a primary role in heart adaptation increased blood volume (stroke volume) to be injected during exhaustive sport exercise and therefore incrementing the final cardiac output.SOMMARIO Il cavallo è da sempre considerato un “campione sportivo” nell’ambito del mondo animale. Le capacità atletiche di questo animale dipendono da molti fattori. I più significativi sono il suo sistema cardiovascolare e le caratteristiche fisiologiche del cuore equino. E’ di notevole importanza il fatto che la frequenza cardiaca del cuore di cavallo a riposo è bassa (25-40 battiti al min) ma che può aumentare rapidamente durante l’esercizio fisico fino a raggiungere i 240 battiti al min e oltre. Inoltre il cuore di cavallo si caratterizza una maggiore durata del potenziale d’azione (0.6-1 s) se paragonato a quella degli altri mammiferi (0.2-0.35 s). Il cuore di equino presenta inoltre significative differenze per quel che riguarda la frequenza, l’ampiezza e la velocità dei transienti di calcio. Per spiegare queste caratteristiche peculiari del cuore di cavallo sono state fatte delle ipotesi. Una più elevata capacità di immagazzinamento del calcio da parte del reticolo sarcoplasmatico, o un’alterazione nella quantità o nella funzionalità di alcune proteine leganti calcio implicate nel processo di eccitamento/contrazione, sono state proposte come possibili cause di queste particolarità dei cardiomiociti equini /Loughrey et al. 2004). Queste caratteristiche hanno fatto ricadere la mia attenzione su due proteine: la “histidine-rich Ca2+-binding protein” (HRC) e la miostatina. L’ HRC è una proteina a cui è stato assegnato un ruolo nella regolazione dell’immagazzinamento del calcio da parte del reticolo sarcoplasmatico e nelle funzionamento cardiaco. La Miostatina invece è un componente della superfamiglia dei “transforming growth factor-” che viene regolata in situazioni fisiologiche e patologiche che coinvolgono la massa muscolare cardiaca, tra cui la modulazione della crescita cardiaca (McKoy G et al. 2007), l’ipertrofia dovuta ad attività atletica (Matsakas A et al. 2006), i processi di rigenerativi post infartuali, l’infiammazione post infartuale (MacLellan et al., 1993, Sharma M et al. 1999), i processi fibrotici del miocardio e le disfunzioni cardiache (Hoenig MR, 2008). L’HRC nel muscolo scheletrico, è risultata per struttura e funzione simile alla calsequestrina, ma sembra avere un ruolo importante e particolare anche nel cuore. L’HRC, una proteina che lega calcio a bassa affinità ma ad elevata capacità, presenta un ruolo nell’immagazzinamento del calcio nel reticolo sarcoplasmatico delle cellule cardiache durante il processo di accoppiamento eccitamento/contrazione (Gregory et al. 2006). Grazie al suo ruolo come regolatore del rilascio di calcio e della funzionalità cardiaca, recentemente all’HRC è stato assegnato un ruolo come ulteriore componente di un complesso molecolare costituito da quattro proteine(Lee H et al. 2001), che localizzato a livello della componente giunzionale del reticolo sarcoplasmatico: il recettore della Rianodina/canale di rilascio del calcio, la calsequestrina e la sue proteine di ancoraggio triadina e giuntina. L’HRC potrebbe rappresentare una proteina chiave in questo complesso, in grado di facilitare il rilascio del calcio dal reticolo sarcoplasmatico mediante l’interazione proteina-proteina. In questo periodo di Dottorato, io ho ipotizzato che le particolari caratteristiche del cuore di cavallo tra cui la durata del potenziale d’azione, potessero trovare una spiegazione nelle caratteristiche e/o alterazione dell’HRC. Inoltre la maggior comprensione dei meccanismi regolativi della miostatina, potrebbero essere di utilità nella pratica di clinica veterinaria poiché l’ipertrofia cardiaca nei cavalli atleti è un fenomeno comune. Per raggiungere gli obiettivi preposti in questo lavoro, ho usato tecniche di Real time PCR e standard PCR all scopo di studiare in dettaglio l’espressione della HRC e della miostatina nelle varie parti anatomiche del cuore equino. Inoltre l’espressione dell’HRC nel cuore equino è stata paragonata nel cuore di bovino. Per studiare invece l’espressione dell’HRC a livello proteico, dopo estrazione e purificazione do membrane del reticolo sarcoplasmatico, sono stati eseguiti esperimenti di Western blotting. Esperimenti di immunofluorescenza su sezioni longitudinali di ventricolo sinistro di cavallo hanno permesso di studiare la localizzazione dell’HRC. I miei risultati mostrano che l’HRC a livello di mRNA è maggiormente espressa nei ventricoli. Inoltre, dal confronto con il bovino, un’altra specie animale di interesse veterinario, è emerso che la sovra espressione dell’HRC è ristretta alla specie equina. La diversa espressione di HRC in atri e ventricoli, potrebbe essere dovuta a caratteristiche intrinseche alle porzioni anatomiche che potrebbero in qualche modo essere evidenziate dalla particolare durata del potenziale d’azione di questa specie. A tal proposito, nell’insieme i miei dati che indicano una overespressione di HRC nei ventricoli, potrebbero rafforzare l’ipotesi che vede l’HRC un regolatore del calcio nel reticolo sarcoplasmatico durante il processo di eccitamento/contrazione. I dati ottenuti riguardanti la espressione del gene della miostatina principalmente nel ventricolo sinistro, potrebbero invece rappresentare un ulteriore sostegno a favore di questa ipotesi, visto che il ventricolo sinistro ha un ruolo primario nel fenomeno di adattamento all’aumento del volume di sangue (stroke volume) che viene pompato durante nelle varie fasi di esercizi fisici estremi, così da incrementare l’output cardiaco finale