ANALISI DEI PROFILI DI ESPRESSIONE DEI MICRORNA NELLA PROGRESSIONE DELL'EPATOCARCINOMA E SVILUPPO DI METODI BIOINFORMATICI PER LA PREDIZIONE DEI GENI TARGET

MicroRNAs (miRNAs) are non-coding RNAs whose role in gene regulation has been discovered and gradually clarified in recent years. The action of miRNAs, like that of other types of non-coding RNA, is based on their physical interaction with gene transcripts (mRNA), the inhibition or decrease of their translation and, as a consequence, of their protein production. As a result, miRNAs biological effect depends on the nature of their targets. Currently, there is not a complete map of the targets for each of the 721 human known miRNAs, but several studies have already shown a direct involvement of many of them in the pathogenetic mechanisms of a large number of diseases including cancer. Hepatitis B (HBV) and C (HCV) viruses infect hundreds of thousands people worldwide every year and cause necroinflammatory diseases which, though in different ways and rates, can cause the development of a chronic disease able to progress and leading to the development of fibrosis, cirrosis and hepatic cancer (HCC); the latter is one of the most aggressive human cancers and its early diagnosis and therapy are still unsolved issues. Thus, many reasons are pressing the scientific community towards the research of novel strategies useful to effectively improve the health management of the disease. As regards miRNAs, several studies have been carried out showing the existence of a clear pattern of specific miRNA expression in hepatic cancer tissue, while their role in the onset and progression of hepatic disease remains largely unclarified and, at the moment, not much studied. Starting from these assumptions, the aims of this study are: - The definition of a protocol for the analysis of miRNAs in tissue samples. - The monitoring of miRNA expression and the identification of those which correlate with hepatic disease progression from viral hepatitis to HCC. - The identification of the roles of these molecules through the research of their specific targets, thanks to the development and the application of bioinformatic tools. The results of this study can be summarized in two main sections: first, the definition of miRNAs expression profiles in the different phases of the hepatic disease progression, starting from slight fibrosis to the onset of hepatocellular carcinoma, obtained with realtime PCR and microarray experiments. Second, the development of a bioinformatic tool able to predict miRNA targets, which has subsequently been applied in order to investigate their function. In conclusion, this study has allowed the identification of some miRNAs whose expression was correlated to distinct phases of hepatic disease and to specific clinical parameters (grading-staging, etiology). Moreover, we investigated the pathways that could be involved by miRNAs differential expression, with the aim and the hope that they will be useful as diagnostic and prognostic instruments and will bring to the development of new therapeutic strategies based on miRNA transfer or on the inhibition of their expression.I microRNA (miRNA) sono RNA non codificanti il cui ruolo di regolazione dell'espressione genica è stato scoperto e via via delucidato in anni recenti. L'azione dei miRNA, non dissimilmente da quella di altre tipologie di RNA non codificanti, si esprime nell'interazione fisica specifica con trascritti genici (mRNA) e nell'impedimento o comunque nella riduzione quantitativa della produzione, a partire da questi ultimi, di proteine. L'effetto biologico del miRNA dipende pertanto dalla natura del suo bersaglio, chiamato target. Non è al momento disponibile una mappa completa dei target di ciascuno dei 721 miRNA umani noti ma numerosi studi hanno già dimostrato per molti di essi un coinvolgimento diretto nei meccanismi patogenetici di numerose patologie, fra cui il cancro. I virus dell'epatite B (HBV) e C (HCV) si trasmettono ogni anno a centinaia di migliaia di persone nel mondo e sono causa di malattie necroinfiammatorie epatiche le quali, pur con percentuali e modalità differenti, possono portare allo sviluppo di una malattia cronica in grado di progredire nel lungo periodo provocando lo sviluppo di fibrosi, cirrosi ed epatocarcinoma (HCC); quest'ultimo è uno dei tumori umani più aggressivi e tanto la sua diagnosi precoce, quanto ancor più la sua terapia, permangono alquanto problematiche. Molte ragioni, quindi, spingono la comunità medico-scientifica alla ricerca di nuove strategie che possano portare a effettivi miglioramenti nella gestione sanitaria di questa patologia. Nel caso dei miRNA, sono già stati effettuati numerosi studi mirati a dimostrare l'esistenza di un preciso schema della loro espressione nel tessuto epatico canceroso, mentre il ruolo che essi possono ricoprire nelle fasi precedenti all'insorgenza del cancro rimane ancora largamente incompreso e, al momento, poco studiato. Partendo da tali presupposti, gli obiettivi di questo studio sono: - La definizione di un protocollo per l'analisi dei miRNA in campioni tissutali. - Il monitoraggio dell'espressione dei miRNA e l'identificazione di quelli che risultino correlati con la progressione dalla patologia epatica ad eziologia virale all'HCC. - L'individuazione del ruolo di tali miRNA attraverso la ricerca dei target specifici, tramite lo sviluppo e l'impiego di metodi bioinformatici. I risultati dello studio si possono riassumere in due sezioni principali: in primo luogo la definizione dei profili di espressione dei miRNA nelle diverse fasi della progressione della malattia epatica a partire dalla fibrosi lieve fino all'insorgenza dell'epatocarcinoma, conseguita grazie all'impiego di metodiche di Real-time PCR e microarray. In secondo luogo lo sviluppo di un metodo bioinformatico di predizione dei geni target, il quale è stato successivamente impiegato nella ricerca della funzione di tali miRNA attraverso la definizione dei loro bersagli. In conclusione, questo studio ha permesso di individuare alcuni dei miRNA caratterizzati dal fatto di avere un'espressione correlata a fasi distinte di malattia epatica e a specifici parametri clinici (grading-staging; eziologia). Sono state inoltre investigate le pathway nelle quali essi potrebbero essere coinvolti, con l'obiettivo e l'auspicio che possano rivelarsi utili come strumenti diagnostici e prognostici e per lo sviluppo di nuove terapie basate sul trasferimento di miRNA o sull'inibizione della loro espressione