Selection and genetic improvement of microorganisms for second generation bioethanol.

Bioethanol produced from biomass is considered an interesting second generation biofuel. To date a cost-effective method for converting biomass into ethanol has not been developed. Consolidated BioProcessing is one of the most attractive strategies aiming to obtain ethanol from biomass by a single microbial phase. In this study, the selection and genetic improvement of microbial strains started in order to develop a microbe for the one-step bioconversion of biomass into ethanol. New efficient cellulolytic microrganisms were isolated and genetically identified. Their hydrolytic activities were remarkable and few strains may have also improvable ethanol production properties. Four hundred wild type yeasts, having optimal fermentative performance, were evaluated for their extracellular enzymatic activities. The yeasts showed interesting hydrolytic activity on pectin, cellulose and starch. In particular, one non-Saccharomyces strain produced efficient cellulolytic enzymes and thirteen S. cerevisiae strains, able to use starch as the sole carbon source, were selected. Extensive biochemical, physiological and genetic studies on their potentially amylolytic enzyme(s) were performed to look into this possible new starch-hydrolytic mechanism. In addition, wheat bran was used, as a model substrate of starchy and cellulosic residues, to design a Separated Hydrolysis and Fermentation (SHF) system aiming at low-cost pre-treatments and high yields. The downstream fermentation, carried out with two Saccharomyces sp. yeasts, resulted in interesting ethanol yields. A metabolic engineering program was conducted in order to obtain an efficient amylolytic yeast for large scale ethanol production. Wild type S. cerevisiae strains with selected industrial traits were engineered to express a fungal codon-optimised glucoamylase. The stable recombinants produced ethanol from soluble and raw starch and could be considered promising for the Consolidated Bioprocessing of starchy industrial residues. On the basis of the preliminary results obtained, this multi-disciplinary work represents a first step towards the development of microbes for the single-step conversion of biomass into ethanol.Il bioetanolo di seconda generazione rappresenta una delle alternative più promettenti tra i biocarburanti. Dal punto di vista biotecnologico, la definizione di un processo economicamente sostenibile per la produzione di bioetanolo da biomassa lignocellulosica è ancora lontana. Lo sviluppo di un microrganismo CBP (Consolidated BioProcessing) capace di idrolizzare i polimeri complessi della biomassa e di convertirli efficacemente in etanolo è una delle strategie più interessanti nel panorama scientifico internazionale. Questo studio ha avviato un programma di selezione e miglioramento genetico di ceppi microbici finalizzato allo sviluppo di un microrganismo adatto alla produzione CBP di bioetanolo da biomassa. Numerosi ceppi microbici cellulosolitici sono stati isolati ed identificati. Le loro attività idrolitiche sono elevate e alcuni isolati hanno dimostrato potenziali capacità fermentative. Inoltre, quattrocento ceppi di lievito wild type sono stati caratterizzati per la loro capacità di produrre enzimi extracellulari. Alcuni ceppi hanno presentato interessanti attività idrolitiche a carico di pectina, cellulosa ed amido. In particolare, un lievito non-Saccharomyces si è distinto per la produzione di efficienti cellulasi e tredici isolati di S. cerevisiae sono stati selezionati per la capacità di utilizzare amido solubile come unica fonte di carbonio. Lo studio ha inoltre sviluppato un sistema SHF (Separated Hydrolysis and Fermentation) per la conversione in etanolo di crusca di grano, scelta come substrato modello di residui agro-industriali a basso costo. Le rese in etanolo, ottenute mediante due ceppi di Saccharomyces sp. opportunamente selezionati, sono risultate promettenti. Un programma di ingenieria genetica ha consentito di ottenere alcuni ceppi mutanti per l'integrazione cromosomica multipla di un gene sintetico codificante per una glucoamilasi fungina. I ceppi ricombinanti, capaci di produrre etanolo da amido grezzo, potrebbero essere impiegati efficacemente in processi CBP a partire da residui industriali amidacei. In base ai risultati preliminari finora conseguiti, questo studio rappresenta un primo passo verso lo sviluppo di microrganismi idonei alla conversione one-step di biomassa in etanolo