Combined effects of seawater acidification and emerging contaminants on marine bivalves

Marine organisms are exposed to a wide range of anthropogenic substances, many of them considered as emerging contaminants due to their growing production and not well-known environmental impact. Among emerging contaminants, pharmaceuticals and personal care products are cause for increasing concern, being bioactive substances widely used in both human and veterinary medicine. Climate changes, such as ocean acidification, could have a powerful effect on pharmaceuticals by altering their environmental behaviour and exposure pathways, thus resulting in an increased toxicity. Furthermore, shifts in environmental parameters could alter marine organism susceptibility to these compounds. In this context, the combined effects of seawater acidification, as predicted in climate change scenarios, and emerging contaminants (the non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID, diclofenac and the metabolic activator caffeine) were investigated for the first time in the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis and the Manila clam Venerupis philippinarum. In adults of both species, we evaluated haemocyte and oxidative stress parameters in order to highlight potential effects due to the combination of seawater acidification and exposure to diclofenac. Other two experiments were carried out to investigate whether the exposure to seawater acidification-diclofenac and acidification–caffeine may affect physiological responses and haemocyte parameters, respectively, in adults of M. galloprovincialis. A flow-through system was used to carry out a three-weeks exposure of the studied bivalves. In the first week, animals were exposed to three pH values (8.1, 7.7, 7.4) only. Thereafter, they were maintained for 7 and 14 days at the three experimental pH values and exposed simultaneously to environmentally relevant concentrations of diclofenac/caffeine (0, 0.05 and 0.5 µg/L). To analyzed haemocyte parameters [total haemocyte count (THC), haemocyte volume and diameter, Neutral Red uptake (NRU), haemocyte proliferation and lysozyme activity) and oxidative stress parameters [superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and cyclooxygenase (COX) activities, lipid peroxidation (TBARS) and DNA strand-break formation), haemolymph, gills and digestive gland were collected after 7, 14 and 21 days of exposure to differing pH value or pH/diclofenac and pH/caffeine combinations. The same experimental set-up was used to study physiological responses in bivalves. After 7, 14 and 21 days, clearance rate, respiration rate and excretion rate were evaluated in individual mussels. The results obtained showed that cellular, biochemical and physiological parameters measured in both mussels and clams were more influenced by pH than by the contaminants (diclofenac and caffeine). In both species, immune parameters were the most responsive to differing experimental conditions. In V. philippinarum, THC and haemocyte proliferation significantly increased with decreasing pH values, after one week of exposure. Interestingly, NRU decreased significantly at pH 7.4, suggesting that clams were trying to compensate a weak pinocytotic capability, due to damaged cell membranes, by increasing the number of circulating haemocytes to maintain immunesurveillance. Despite COX is involved in inflammatory processes and it should be inhibited by NSAIDs, no significant effects due to diclofenac were revealed in both bivalve species, whereas pH significantly influenced this enzymatic activity. However, an opposite pattern of variation was observed in tissues of clams and mussels kept at low pH. In M. galloprovincialis, differing modulation patterns were found in physiological rates measured after 7, 14 and 21 days of exposure to the experimental conditions tested. Reduction in filtration and nitrogen excretion and increase in oxygen consumption highlighted stressful condition under reduced pH. The combined effects of seawater acidification and diclofenac were also investigated in larvae of the clam V. philippinarum. An experimental flow-through system was used to carry out a 96 hours exposure of clam larvae. Fertilized eggs were exposed to two different levels of pH (8.1 and 7.7) combined with two concentrations of diclofenac (0 and 0.5 µg/L). Throughout the experiment, larval mortality and growth were daily checked and recorded. At the end of the experiment, pools of larvae were constituted to assess oxidative stress (CAT activity) and lipid peroxidation. About 50% mortality was observed in larvae exposed to pH 7.7, both with and without diclofenac, while mortality was lower than 10% in controls kept at pH 8.1. Low pH significantly reduced shell length and height and altered their ratio. Diclofenac significantly decreased shell length only, the reduction being higher at pH 7.7 than at pH 8.1. A strong tissue prolapse outside the shell was observed in larvae kept at pH 7.7. pH significantly increased CAT activity in larvae kept at pH 7.7 for 96 hours, whereas no significant difference in lipid peroxidation was found among treatments. This study demonstrated that seawater acidification negatively influenced susceptibility of V. philippinarum larvae to environmentally relevant concentrations of diclofenac, mostly by altering shell growth.Gli organismi marini , soprattutto in ambienti costieri ed estuarini, sono continuamente esposti ad una vasta gamma di sostanze di origine antropica, tra cui molte vengono considerate “contaminanti emergenti” a causa della crescente produzione ed immissione in ambiente a fronte di una quasi completa assenza di informazioni relative al loro impatto sul biota. Tra questi composti, una crescente attenzione viene data ai principi attivi contenuti in farmaci per uso medico e veterinario e in prodotti per la cura e l’igiene personale di largo consumo. Le problematiche derivanti dal continuo rilascio di nuovi contaminanti in ambiente si inseriscono in un quadro di cambiamenti climatici, riconducibili all’aumento delle emissioni di anidride carbonica in atmosfera, in particolare all’acidificazione delle acque marine. Una riduzione dei valori di pH in mare potrebbe incidere pesantemente sulle caratteristiche chimico-fisiche dei farmaci rilasciati in ambiente, alterandone distribuzione, biodisponibilità e potenziale tossicità. D’altro canto, variazioni ambientali, come quelle previste in uno scenario di cambiamento climatico, potrebbero modificare la suscettibilità degli organismi marini nei confronti di questi composti. In questo contesto, il presente studio ha voluto indagare gli effetti combinati dell’acidificazione e di contaminanti emergenti (il diclofenac, un antiinfiammatorio non steroideo, e la caffeina, un attivatore metabolico) in due bivalvi marini, il mitilo Mytilus galloprovincialis e la vongola Venerupis philippinarum. In organismi adulti di entrambe le specie, sono stati valutati parametri morfo-funzionali negli emociti e risposte legate allo stress ossidativo in condizioni di esposizione a pH ridotto e a diclofenac . Solo nel mitilo si sono indagati gli effetti delle medesime condizioni sperimentali sulle performance fisiologiche e, in un ulteriore esperimento, gli effetti combinati di acidificazione e caffeina su parametri cellulari negli emociti. Per condurre queste diverse sperimentazioni, ognuna della durata di una settimana, è stato utilizzato un impianto a flusso continuo appositamente allestito. Durante la prima settimana gli animali sono stati esposti a tre diversi valori di pH (8.1, 7.7, 7.4), nelle successive due settimane alle stesse condizioni di pH si è associata un’esposizione a concentrazioni ambientali di diclofenac o caffeina (0, 0.05 and 0.5 µg/L). Dopo 7, 14 e 21 giorni di esposizione alle condizioni sperimentali sopra indicate, sono stati prelevati emolinfa, branchie e ghiandola digestiva e misurati i parametri emocitari [numero di emociti circolanti (THC), volume e diametro degli emociti, saggio di assunzione del Rosso Neutro (NRU), saggio di proliferazione cellulare, attività del lisozima] e i parametri di stress ossidativo [attività della superossido dismutasi (SOD), della catalasi (CAT) e della cicloossigenasi (COX), perossidazione lipidica (TBARS) e rotture al DNA (DNA strand-breaks)]. Analogamente, con la stessa cadenza temporale, sono state misurate nei mitili le risposte fisiologiche (tasso di filtrazione, tasso di respirazione e tasso di escrezione). Nel complesso i risultati ottenuti evidenziano che, sia nei mitili, sia nelle vongole, le risposte risposte biochimiche, cellulari e fisiologiche indagate sono state maggiormente influenzate dalla riduzione di pH che dall’esposizione ai contaminanti (diclofenac e caffeina). In entrambe le specie, i parametri emocitari hanno risposto in maniera più sensibile alle diverse condizioni sperimentali. In V. philippinarum, THC e proliferazione cellulare sono aumentati significativamente al diminuire del pH dopo una settimana di esposizione. I valori di NRU invece hanno mostrato una significativa diminuzione a pH 7.4, suggerendo quindi la messa in atto di meccanismo di compensazione dell’indebolita capacità di pinocitosi, dovuta ad un possibile danno alla membrana cellulare, attraverso un aumento dei valori di THC, in modo da mantenere adeguate condizioni di immunosorveglianza. Nonostante la COX sia coinvolta nei processi infiammatori e venga normalmente inibita dagli antiinfiammatori non steroidei, in nessuna delle due specie la sua attività è risultata significativamente influenzata dall’esposizione a diclofenac. Viceversa si è evidenziato un effetto significativo del pH, anche se con un opposto pattern di variazione in mitili e vongole dopo esposizione a pH ridotto. In M. galloprovincialis sono stati rilevati differenti pattern di modulazione nelle risposte fisiologiche misurate dopo 7, 14 and 21 giorni di esposizione alle condizioni sperimentali saggiate. In particolare, una riduzione della filtrazione e dell’escrezione azotata ed un concomitante aumento del consumo di ossigeno hanno messo in luce condizioni di stress associate ad una riduzione del pH. Gli effetti combinati di acidificazione dell’acqua di mare e di esposizione a diclofenac sono stati indagati anche durante la fase larvale della vongola V. philippinarum. In un impianto sperimentale a flusso continuo, uova fecondate sono state esposte per 96 ore a due diversi valori di (8.1 and 7.7) in combinazione con due concentrazioni di diclofenac (0 and 0.5 µg/L). Durante l’esperimento è stata rilevata ogni giorno la mortalità delle larve ed è stata misurata la crescita della conchiglia. Alla fine dell’esperimento sono stati raccolti campioni di larve per la determinazione dell’attività della CAT e della perossidazione lipidica. Una mortalità intorno al 50% è stata registrata a pH 7.7, sia in presenza che in assenza di diclofenac, ma tale valore è sceso a meno del 10% a pH 8.1. A pH 7.7 si è osservata una riduzione significativa delle dimensioni della conchiglia (lunghezza e altezza) e un’alterazione del loro rapporto. L’esposizione a diclofenac ha portato ad una significativa riduzione della sola lunghezza, più marcata a pH 7.7 che a pH 8.1. A pH ridotto sono state osservate larve anomale con un prolasso dei tessuti molli che fuoriuscivano dalla conchiglia. Nelle larve mantenute a pH ridotto si è riscontrato un aumento significativo dell’attività della CAT, ma nessuna variazione nei livelli di perossidazione lipidica rispetto ai controlli. Questo studio ha fornito i primi risultati sui possibili effetti dell’acidificazione nello sviluppo larvale di V. philippinarum , evidenziando come una riduzione di pH possa influire negativamente sulla sensibilità delle larve di vongola al diclofenac, con ripercussioni soprattutto sulla crescita della conchiglia