A genomic investigation of the ripening regulation in peach fruit

The aim of this work is the study of the gene regulation of peach ripening with a genomic approach. The microarray platform μPEACH 1.0 and Real Time PCR experiments have been used in order to find out genes involved in peach ripening (219 genes up-regulated and 188 down-regulated during the transition from stage S3II to stage S4I) and to study the effect of two hormones (auxin and ethylene) and 1-MCP (1-Methylcyclopropene), an inhibitor of ethylene receptors, during ripening. This approach has confirmed that ethylene can affect the expression of many genes and has confirmed its basic role in the regulation of ripening of peach fruit (102 genes induced and 80 repressed by treatment with ethylene associated with the S3II-S4I transition) and, more generally, of climacteric fruit (Alba et al., 2005). Also it has been possible to show that auxin is actively involved in the ripening of peaches (43 and 48 genes induced and repressed, respectively, by the NAA treatment and modulated by the transition from pre-climacteric to climacteric stage) but with a role independent from ethylene. Indeed, many genes involved in the biosynthesis, transport, perception and signaling of auxin had increased expression in the mesocarp during ripening. Moreover, there is an important cross-talk between auxin and ethylene, with genes in the auxin domain regulated by ethylene, as ctg3721 encoding a PIN auxin efflux facilitator, and genes in the ethylene domain regulated by auxin, as ACS1 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase). The microarray analyses carried out with 1-MCP treated fruit revealed that this chemical modified the expression of 121 genes. Besides inducing ethylene-, auxin- and ripening-repressed genes and repressing ethylene-, auxin- and ripening-induced genes, also genes either induced or repressed by ripening, auxin and 1-MCP were discovered. Thus, blocking ethylene perception with 1-MCP can induce ripening-related effects through a not-yet identified mechanism. Some of the genes identified as “ripening-related” and “belonging to either auxin or ethylene domains” were mapped with the bin mapping technique. In particular, the Prunus reference map constructed with an almond (Prunus dulcis) x peach (Prunus persica) F2 population (Howad et al., 2005) has been used, namely, the TxE population (Texas, almond x Earlygold, peach), available in the laboratory of prof. Pere Arus (IRTA, Barcelona, Spain). Some of these genes are transcription factors, whose expression parallel peach ripening. A functional analysis of these TF genes is a possible way to study the genetic regulation involved in peach ripening. Thus an analysis of the promoters of a gene, named PpIAA57, coding for an Aux/IAA protein and of a gene, named PpbZIP298, coding for a bZIP transcription factor has been carried out. These genes present a high transcript abundance in ripe fruit and they are up-regulated by the S3II-S4I transition. Nonetheless, their expression is not influenced by treatments with either ethylene or auxin. These promoter sequences have been evaluated with a bioinformatic analysis to discover the presence of cis-elements. Progressive deletions of the PpbZIP298 and PpIAA57 promoters, fused with the GUS reporter gene, were used for tobacco stable transformation and for agroinfiltration experiments performed on peach fruit. Unexpectedly, the strength of the two promoters resulted to be very weak, despite the length of the used fragments. Anyway, a possible putative regulatory region has been identified in the 5' UTR of PpbZIP298.Lo scopo di questo lavoro è lo studio della regolazione genica durante la maturazione della pesca mediante un approccio di tipo genomico. La piattaforma μPEACH 1.0 ed esperimenti di Real Time PCR sono stati utilizzati per scoprire geni coinvolti nella maturazione della pesca (219 geni indotti e 188 repressi durante la transizione dallo stadio S3II allo stadio S4I) e per studiare l’effetto di due ormoni (auxina ed etilene) e di un inibitore dei recettori dell’etilene, 1-MCP (1-Metilciclopropene) durante la maturazione. Questo approccio ha confermato che l’etilene controlla l’espressione di molti geni e ha avvalorato il suo ruolo fondamentale nella regolazione della maturazione della pesca (102 geni indotti e 80 repressi dal trattamento con etilene associato alla transizione S3II-S4I) e, più in generale, dei frutti climaterici (Alba et al., 2005). Inoltre è stato possibile dimostrare che l’auxina è coinvolta attivamente nella maturazione delle pesche (43 e 48 geni rispettivamente indotti e repressi dal trattamento con NAA e modulati dalla transizione da stadio pre-climaterico a quello climaterico) ma con un ruolo indipendente dall’etilene. Infatti, molti geni coinvolti nella biosintesi, trasporto, percezione e trasduzione del segnale dell’auxina presentano un incremento di espressione nel mesocarpo durante la maturazione. Inoltre, è presente un importante “cross-talk” tra auxina ed etilene, con geni appartenenti al dominio dell’auxina regolati dall’etilene, come nel caso del ctg3721 codificante un facilitatore di efflusso di auxina di tipo PIN e geni appartenenti al dominio dell’etilene regolati dall’auxina, come ACS1 (acido 1-amminociclopropan-1-carbossilico sintasi). Gli esperimenti di microarray condotti su frutti trattati con 1-MCP hanno rivelato che questo composto chimico modifica l’espressione di 121 geni. Oltre a indurre geni repressi dall’etilene, dall’auxina e dalla maturazione e reprimere geni indotti dall’etilene, dall’auxina e dalla maturazione, è stato scoperto che l’1-MCP può indurre o reprimere geni che sono regolati nello stesso modo dalla maturazione e dall’auxina. Quindi il blocco della percezione dell’etilene con 1-MCP è in grado di indurre degli effetti legati alla maturazione attraverso un meccanismo non ancora identificato. Alcuni dei geni identificati come “legati alla maturazione” e “appartenenti sia al dominio dell’auxina che a quello dell’etilene” sono stati mappati mediante la tecnica del “bin mapping”. In particolare, è stata utilizzata la mappa di riferimento di Prunus costruita incrociando mandorlo (Prunus dulcis) con pesco (Prunus persica) con lo scopo di ottenere una popolazione F2 (Howad et al., 2005) chiamata popolazione TxE (Texas, mandorlo x Earlygold, pesco), disponibile presso il laboratorio del prof. Pere Arus (IRTA, Barcellona, Spagna). Alcuni di questi geni sono dei fattori di trascrizione, la cui espressione aumenta durante la maturazione della pesca. Un’analisi funzionale di questi fattori di trascrizione è un possibile modo per studiare la regolazione genica coinvolta nella maturazione della pesca. Quindi è stata condotta un’analisi dei promotori di un gene codificante una proteina di tipo Aux/IAA chiamato PpIAA57 e di un gene codificante per un fattore di trascrizione di tipo bZIP chiamato PpbZIP298. Questi geni presentano un’elevata abbondanza di trascritti nei frutti maturi ed inoltre sono regolati positivamente durante la transizione S3II-S4I. Tuttavia, la loro espressione non è influenzata dai trattamenti con etilene o auxina. Le sequenze di questi due promotori sono state analizzate mediante un’analisi di tipo bioinformatico per scoprire la presenza di cis-element. Delezioni progressive dei promotori dei due geni PpbZIP298 e PpIAA57, fuse con il gene reporter GUS, sono state utilizzate per la trasformazione permanente di piante di tabacco e per esperimenti di agroinfiltrazione condotti su pesche. Inaspettatamente, la forza dei due promotori sembra essere molto debole a discapito della lunghezza dei frammenti utilizzati. Comunque, una possibile putativa regione regolativa è stata identificata nel 5' UTR del gene PpbZIP298