STUDIO DEI MECCANISMI DI RESISTENZA A FARMACI ANTI-ANGIOGENICI IN MODELLI TUMORALI

Angiogenesis is fundamental for tumour growth and metastasis. Anti-angiogenic therapy has recently been added to the panel of cancer therapeutics. In pre-clinical models and patients, however, benefits from angiogenesis inhibitors, mainly targeting the VEGF pathway, have generally been short-term. Although several mechanisms have been postulated, mechanisms of resistance to anti-angiogenic drugs remain largely unknown. Anti-angiogenic therapies by hitting the vasculature increase hypoxia and cut nutrients availability in tumors. Understanding the complex effects of hypoxia on tumour cells is indeed necessary to unravel how tumours react and adapt to angiogenesis blockade, with the final aim to improve the therapeutic response. In this project, we investigated the heterogeneous responses of tumor cells to severe hypoxia in vitro and correlated them to the outcome of anti-VEGF therapy in vivo. By using a panel of cancer cell lines with different metabolic profiles, we demonstrated that cell toxicity under hypoxic conditions depends at least in part by exhaustion of glucose in the culture medium and it is enhanced in tumour cells metabolically dependent to glucose compared to cells dependent from other substrates for ATP production. Hypoxia resistant/highly glycolytic and hypoxia sensitive/poorly glycolytic cells have been identified and used to investigate how tumours with different metabolic features respond to anti-VEGF therapy. We observed a marked reduction in glucose and ATP levels and an increase in hypoxia in tumours following treatment with an anti-VEGF antibody. In highly glycolytic tumours treatment caused reduction in tumour volume and increased areas of necrosis, whereas in poorly glycolytic tumours only minor changes were observed. After long-term administration of the anti-VEGF antibody, however, highly glycolytic tumours become resistant to the therapy, while poorly glycolytic tumours shrank. To investigate the molecular basis of this phenomenon, we analyzed AMPK activation in these tumours. AMPK is a kinase which acts like a sensor of the intracellular ATP levels and we hypothesize that it may coordinate cellular responses to anti-VEGF therapy, considering the metabolic consequences of this treatment. By in vitro experiments under hypoxia and glucose starvation, two conditions which mimic those found in the tumor microenvironment, we discovered a defect in the AMPK pathway in tumor cells resistant to chronic anti-VEGF therapy. Poor activation of the AMPK pathway has important consequences on metabolic pathways governed by AMPK - including mTOR and the metabolism of lipids - and on cellular proliferation. In conclusion this study demonstrated that the glycolytic phenotype of tumors - evaluable also in patients by techniques such as 18FDG-PET - and determination of the activity of the AMPK pathway are helpful parameters to predict tumor response to anti-VEGF treatment in experimental tumor models.Il processo di angiogenesi è fondamentale per favorire lo sviluppo dei tumori e la loro disseminazione metastatica. Per tali motivi, la terapia anti-angiogenica è recentemente entrata a far parte delle terapie utilizzate contro il cancro. In modelli pre-clinici e nei pazienti, gli inibitori dell'angiogenesi ed in particolare la neutralizzazione del VEGF hanno dimostrato tuttavia di avere benefici generalmente di breve durata. Sebbene alcuni meccanismi di resistenza siano stati dimostrati, i parametri responsabili delle diverse risposte dei tumori alla terapia anti-angiogenica rimangono ancora ampiamente sconosciuti. Le terapie anti-angiogeniche, colpendo la vascolatura, inducono nel tumore un aumento dell'ipossia ed una riduzione dei nutrienti. La valutazione degli effetti dell'ipossia sulle cellule tumorali è dunque fondamentale per consentire di comprendere meglio come i tumori reagiscano e si adattino al blocco dell'angiogenesi, con lo scopo finale di migliorare la risposta terapeutica. In uno studio precedente avevamo osservato come linee di carcinoma ovarico rispondessero in maniera eterogenea in termini di sopravvivenza a condizioni di ipossia. In questo progetto abbiamo esteso tali osservazioni ad altre linee tumorali andando a correlare le risposte ai trattamenti in condizioni ipossiche ad aspetti metabolici delle cellule tumorali ed in particolare al loro fenotipo glicolitico. Abbiamo dimostrato come la tossicità da ipossia dipenda almeno in parte dall'esaurimento del glucosio nel terreno di coltura e sia dunque maggiore nel caso di cellule tumorali metabolicamente dipendenti dal glucosio - quali le cellule OC316 - rispetto a cellule dipendenti da altri substrati per la produzione di ATP, quali le cellule IGROV-1. Tali linee tumorali sono state quindi utilizzate come prototipi per investigare come tumori con diverso fenotipo glicolitico rispondano alla terapia con un anticorpo neutralizzante il VEGF. Abbiamo osservato che nei tumori trattati con un breve ciclo di anti-VEGF si ha una marcata riduzione dei livelli di glucosio e di ATP ed un aumento di ipossia rispetto ai tumori di controllo. Nei tumori altamente glicolitici tale trattamento causa una riduzione delle dimensioni e un aumento delle aree di necrosi, a differenza dei tumori scarsamente glicolitici, la cui vitalità non viene inizialmente compromessa. Quando i tumori vengono trattati cronicamente con anti-VEGF, i tumori altamente glicolitici diventano tuttavia resistenti alla terapia mentre i tumori scarsamente glicolitici vanno incontro a progressiva regressione. Per approfondire le basi molecolari di tale fenomeno, abbiamo indagato l'attivazione di AMPK in questi tumori. AMPK è una chinasi che agisce come sensore dei livelli di ATP nelle cellule ed era dunque probabile che intervenisse nelle risposte cellulari alla terapia anti-angiogenica, viste le conseguenze metaboliche di tale trattamento. Quest'ultima parte del progetto ha consentito di scoprire un'anomalia a livello della via di AMPK nelle cellule OC316, rivelata da esperimenti in vitro in condizioni di stress quali l'ipossia e la deprivazione di glucosio. Tale difetto di attivazione di AMPK ha conseguenze su importanti vie metaboliche controllate da AMPK quali mTOR, il metabolismo dei lipidi e sulla proliferazione cellulare, e secondo la nostra ipotesi di lavoro, potrebbe spiegare i diversi comportamenti dei tumori ai trattamenti anti-angiogenici. In conclusione, questo studio ha dimostrato come il metabolismo glicolitico delle cellule tumorali - valutabile anche nei pazienti con metodiche quali la 18FDG-PET - sia rilevante per predire la risposta dei tumori ad anticorpi anti-VEGF ed ha consentito di identificare il ruolo della via dell'AMPK nella risposta a tali farmaci