Caratterizzazione e plasticità differenziativa di popolazioni cellulari staminali isolate da sangue periferico

Stem cells are primitive undifferentiated cells with unlimited proliferative capacity and defined differentiative abilities under specific stimula. Over the last decade, great interest has been addressed versus the clinical use of adult stem cells that, in comparison to embryonic stem cells, do not involve the destruction of embryos to be obtained and therefore do not induce any ethical problem. Adult stem cells are mostly multipotent and are present within niches in adipose tissue, bone marrow and skin of adults and children. Experimental studies have shown that multipotent stem cells are present in animal and human peripheral blood and their potentialities make them ideal candidate for clinical programs of cell therapy to restore structural or functional tissue defects that are difficult to be solved with traditional medical therapies. It was also shown that, using in vitro defined culture conditions, they can be modified acquiring cardiomyocyte phenotype. After 24h exposure with DNA demethylating chemical 5-azacitidine (5-AZA), the commonest strategy to induce the in vitro cardiac differentiation, MSC demonstrated a cardiomyocyte-like ultrastructure, including typical sarcomeres, a centrally positioned nucleus and atrial granules. The expression of contractile protein genes for myosin heavy chain, myosin light chain and α-actin, confirmed them to be similar to the foetal ventricular cardiomyocytes. In the last decade, the development of the heart valve tissue engineering provided promises to obtain fully compatible grafts able, after transplantation, to be in vivo remodelled. Researchers have demonstrated the efficacy of acellular and natural matrices to repair muscle, bone and trachea. Some of the most widely used techniques have involved detergents such as sodium dodecylsulphate (SDS), sodium deoxycholate (SD), sodium cholate (SC), Triton X–100 (TX) and trypsin enzyme. TRICOL, a technique employing TX, sodium cholate (SC), hypo- and hyper-tonic solutions and Benzonase has been developed by Spina et al. to obtain porcine aortic and pulmonary valves. Acellular matrices have been tested in combination or not with differentiated tissue-specific cells (endothelial and/or smooth muscle cells), autologous or allogenic stem cells. Seeding peripheral blood-derived autologous cells on acellular matrices could optimize the in vivo functionality of the implant to its final complete integration. The aim of this thesis has been the isolation of circulating cells from peripheral blood to be used in tissue engineering strategies. The study envolved minipig as animal model. CD44high, CD106+, CD90low, SLA-DRlow, CD45-, CD34-, CXCR4- (CSP) fibroblastic cells have been isolated using the strategy by adherence to plastic. The long term expansion has been performed for 39 passages and demonstrated that CSP phenotype and morphology are highly stable, as cytometrical study and microscopical analysis demonstrated on subcultures VIII, XXIV and XXXIX. Moreover, the specific induction with adipogenic, osteogenic and cardiomyogenic media revealed that CSP cells are able to specifically respond to the induction stimula, accumulating lipids within cytoplasm, producing mineralized extracellular matrix and expressing cardiomyogenic markers such as phospholamban, alpha actin muscle specific and troponin T. In order to test the clinical potentialities of CD44high, CD106+, CD90low, SLA-DRlow, CD45-, CD34-, CXCR4- circulating cells, in cardiological field, the seeding of CSP cells has been performed on acellular porcine valves (VD) (aortic and pulmonary) as scaffolds. The cellular adhesion has been studied by SEM at different time points (7, 14, 28, 35 and 42 days). The morphological study by SEM demonstrated that CSP cells colonized the seeding surface and organized themselves into continuous monolayers. The histological study by immunofluorescence showed the presence of elastin and collagen (IV and I) whereas immunohystochemistry demonstrated the positivity of cells for alpha actin.Le cellule staminali sono cellule primitive indifferenziate, dotate di capacità proliferativa illimitata e in grado di differenziare in cellule specializzate in presenza di stimoli specifici. Nell’ultimo decennio, grande interesse è stato rivolto all’impiego in campo medico di cellule staminali adulte che, rispetto alle cellule staminali embrionali totipotenti, non comportano la distruzione dell’embrione per il loro ottenimento e pertanto non sollevano alcun problema di carattere etico. Le cellule staminali adulte sono cellule prevalentemente multipotenti, identificate in nicchie a livello del tessuto adiposo, del midollo osseo e della cute di individui adulti e bambini. Studi sperimentali hanno evidenziato che nel sangue periferico animale e umano sono presenti cellule ad alta capacità plastica e che dunque potrebbero essere utilizzate in clinica per lo sviluppo di programmi di terapia cellulare ed il recupero di danni tessutali refrattari alle terapie mediche classiche. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno dimostrato di essere idonee all’impiego in vivo per lo sviluppo di programmi di terapia cellulare. È stato inoltre dimostrato che, in definite condizioni di coltura, le cellule MSC possono acquisire un fenotipo simil-cardiomiocitario. La strategia più comune utilizzata per indurre il loro differenziamento cardiomiogenico in vitro è il trattamento per 24 ore con la 5-azacitidina (5-AZA), un agente chimico demetilante del DNA. Dopo induzione, le cellule mostrano una morfologia miotubulare, caratterizzata dalla presenza di unità sarcomeriche, un nucleo centrale e tipici granuli atriali. Similmente ai cardiomiociti fetali ventricolari, esse esprimono proteine contrattili, quali l’α-actina, la catena pesante (MHC) e leggera della miosina (MLC). Nel corso degli ultimi dieci anni, lo sviluppo dell’ingegneria tessutale delle valvole cardiache ha aperto un nuovo orizzonte verso l’utilizzo di un costrutto biocompatibile in grado di essere rimodellato dopo l’impianto. Numerosi studi hanno messo in luce l’efficacia delle matrici naturali acellulari per il recupero di danni tessutali a livello muscolare, osseo e tracheale. I metodi sperimentati per la decellularizzazione di valvole aortiche e polmonari hanno previsto l’uso di detergenti quali il sodio dodecilsolfato (SDS), il sodio deossicolato (SD), il sodio colato (SC), il Triton X–100 (TX) e l’enzima tripsina. Il trattamento TRICOL, che comprende l’uso di TX, sodio colato (SC), soluzioni ipo- ed iper-toniche e Benzonase, è stato sviluppato da Spina e collaboratori per la preparazione di valvole porcine aortiche e polmonari. L’ingegnerizzazione della matrice con cellule autologhe isolate da sangue periferico potrebbe ottimizzare l’attecchimento dell’impianto e consentire il suo mantenimento in sede fino a completa integrazione. Lo scopo della tesi è stato isolare cellule circolanti multipotenti da sangue periferico, idonee ad applicazioni di ingegneria tessutale. Lo studio è stato eseguito utilizzando il modello animale minipig. Sono state isolate popolazioni fibroblastoidi mediante la tecnica di adesione alla plastica, aventi fenotipo CD44high, CD106+, CD90low, SLA-DRlow, CD45-, CD34-, CXCR4- (CSP). L’espansione a lungo termine, eseguita per 39 passaggi, ha dimostrato che le popolazioni CSP sono altamente stabili da un punto di vista fenotipico e morfologico, come dimostrato mediante analisi citometrica e di microscopia ottica su subcolture intermedie VIII, XXIV e XXXIX. Inoltre, la specifica induzione con terreni differenziativi in senso adipogenico, osteogenico e cardiomiogenico ha dimostrato che le cellule CSP sono cellule plastiche, che rispondono agli stimoli in modo specifico accumulando trigliceridi, producendo matrice extracellulare mineralizzata ed esprimendo marcatori cardiomiogenici quali il fosfolambano, l’alfa-actina muscolo specifica e la troponina cardiaca T. Allo scopo di valutare le potenzialità di impiego in campo cardiologico di popolazioni circolanti con immunofenotipo CD44high, CD106+, CD90low, SLA-DRlow, CD45-, CD34-, CXCR4-, è stata oggetto di studio la crescita delle cellule CSP su matrici valvolari decellularizzate (VD) aortiche e polmonari. La valutazione dell’adesione è stata eseguita mediante analisi SEM a differenti intervalli di tempo (7, 14, 28, 35 e 42 giorni). Lo studio morfologico mediante analisi SEM ha dimostrato la colonizzazione della superficie di semina da parte delle cellule CSP e la loro organizzazione in monostrati continui. Lo studio istologico mediante immunofluorescenza ha evidenziato sui campioni la presenza di elastina e di collagene (IV e I) mentre lo studio immunoistochimico ha dimostrato la positività delle cellule per l’alfa-actina cellulare scheletrica