Identification and expression studies of orthologues of vertebrate haematopoietic and neural stem cell markers in the urochordate Botryllus schlosseri

All multicellular organisms originate from a small set of totipotent embryonic stem cells that differentiate into a structured body plan during embryogenesis. These cells share the common morphology of undifferentiated cells with a high nucleus/cytoplasm ratio, few cytoplasmic organelles and absence of specific functions, and reach their full functionality through various steps in which they progress towards their specificity. Stem cells with different plasticity persist in tissues during the whole life of the organism and they can be useful in replacing adult cells after their damage or death. Ascidians are invertebrate chordates, members of the subphylum Tunicata or Urochordata that represents the sister group of vertebrates (Delsuc et al., 2006). They offer the opportunity to investigate and compare the behaviour of both embryonic and adult stem cells (Tiozzo et al, 2008), as adult stem cells play important roles in various processes, such as the regenerative abilities in solitary ascidians and the cyclical renewal of the colony in compound ascidians (Berrill, 1951). In these organisms, it is still debated if there are separate lineages for somatic and germ cell lines or if there is a single population of pluripotent stem cells able to differentiate according to the niche in which they land (Laird et al, 2005). However, it is well known that, in close proximity to the ascidian pharynx, “haematopoietic nodules” are present (Ermak, 1975; Rinkevich et al, 2013) in which haematopoiesis occurs. The endostyle itself has been identified as a novel stem cell niche in the colonial species B. schlosseri (Voskoboynik et al, 2008). In addition, morphological data suggest the presence of circulating undifferentiated cells (haemoblasts) able to proliferate and give rise to terminally differentiated cells (Kawamura et al, 2006). Relevant studies were also carried out in the neural lineage of ascidians, in which neural progenitor cells, able to regenerate the brain after extirpation, were found (Bollner et al, 1995). In B. schlosseri, during the generation change, there are bud primordial cells, probably deriving from a pool of long-living stem cells (Tiozzo et al, 2009), able to give rise to the neural complex. The latter species offers the possibility to compare the genetic control of neurogenesis during embryogenesis and blastogenesis. With the aim of better elucidating the process of haematopoiesis and neurogenesis during the colonial blastogenetic cycle (i.e., the interval of time between a generation change and the following one), I screened the B. schlosseri genome and transcriptome, looking for genes/transcripts showing similarity to vertebrate molecular markers of haematopoietic and neural stem cells. On these sequences, after an in silico translation, I performed the phylogenetic reconstruction that, always, gave tunicate as the vertebrate sister cluster. The four mammalian orthologous genes, used as markers for the recognition of haematopoietic progenitor cells, identified in B. schlosseri, are bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3 and bsgata4/5/6. The ISH assay, performed by antisense specific riboprobes, on haemocyte monolayers and colony sections, resulted in a labelling of the sub-endostylar haemolymph lacunae. These results matches previously morphological data that identified the endostyle as a stem cell niche, strengthening our idea to use bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3 and bsgata4/5/6 genes for the identification of haematopoietic stem cells in B. schlosseri. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) highlighted the over-expression of the considered genes in the mid-cycle (MC) phase of the blastogenetic cycle. During this phase, there is the formation of new secondary buds emerging from the primary buds. The high expression levels of bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3 and bsgata4/5/6 genes in the MC phase reflect the presence of undifferentiated cells involved in proliferative and differentiation events required for giving rise to the new blastogenetic generation. For the neural lineage, I identified and characterised two transcripts identified as orthologues of vertebrate neural stem cell markers Sox2 and Msi2 (BsSox2 and BsMsi2). In addition to these genes, I also examined the expression, during the blastogenetic cycle, of a panel of genes already known to be involved in ascidian larval neurogenesis, i.e., orthologues of Pax2/5/8, Hox1 and Hox3. ISH with riboprobes for BsSox2, BsMsi2, BsPax2/5/8, BsHox1 and BsHox3 revealed a common labelling of the endostyle niche and of the primordia of the branchial basket of the bud. Like the above-considered haematopoietic markers, the presence of bssox2, bsmsi2, bspax2/5/8, bshox1 and bshox3 transcripts in the cells of the region known to be a stem cell niche, led us to conclude not only that our probes identified undifferentiated cells but even that in B. schlosseri a single population of pluripotent stem cells that can differentiate into haematopoietic or neural cells depending on the microenvironmental signals is probably present. qRT-PCR showed high expression level of all the putative neural markers considered in the MC phase. Again, in this phase new secondary buds are produced from primary buds. Every new bud needs its own neural complex and this requires the proliferation of undifferentiated cells to originate neural gland rudiment and cerebral ganglion. The bssox2, bsmsi2, bspax2/5/8, bshox1 and bshox3 increased expression associated with these neurogenesis events support their involvement in neural stem cell identification. Moreover, haematopoietic and neural probes reveal additional labelling in B. schlosseri tissues (i.e. oocyte, tissues of primary bud and secondary bud, morula cells). This stimulates additional future studies for better comprehension of the role of these genes in B. schlosseri.Tutti gli organismi pluricellulari originano da un piccolo set di cellule staminali embrionali totipotenti che differenziano in un piano corporeo completo durante l’embriogenesi. Queste cellule mostrano la tipica morfologia delle cellule indifferenziate con un elevato rapporto nucleo/citoplasma, pochi organelli citoplasmatici, assenza di funzioni specifiche e raggiungono il completo differenziamento attraverso stadi successivi. Le cellule staminali persistono nei tessuti durante l’intera vita dell’organismo, in diversi gradi di differenziamento, al fine di fornire cellule di ricambio in seguito a danno o morte cellulare delle cellule tissutali. Le ascidie sono invertebrati marini appartenenti al phylum dei Cordati ed al sub-phylum dei Tunicati o Urocordati, considerato sister group dei Vertebrati (Delsuc et al, 2006). Esse offrono l’opportunità di investigare e comparare il comportamento di cellule staminali adulte ed embrionali (Tiozzo et al, 2008). La presenza di cellule staminali adulte si evince da vari processi come la rigenerazione in ascidie solitarie e il ciclico ricambio generazionale nelle ascidie coloniali (Berrill, 1951). Nelle ascidie è ancora molto dibattuta la presenza di distinti progenitori staminali multipotenti che portano alla formazione della linea somatica e di quella germinale, o al contrario, di progenitori staminali pluripotenti, in grado di differenziare in entrambe le linee, in base alla nicchia in cui si trovano (Laird et al, 2005). É risaputo che in prossimità del faringe delle ascidie, sono presenti noduli emopoietici (Ermak, 1975) o aggregati cellulari contenenti cellule staminali (Rinkevich et al, 2013). L’endostilo stesso è inoltre stato identificato come una nicchia di staminalità nell’ascidia coloniale B. schlosseri (Voskoboynik et al, 2008). Dati morfologici suggeriscono la presenza di cellule circolanti indifferenziate (emoblasti) capaci di proliferare e dare origine a cellule completamente differenziate (Kawamura et al, 2006). Ulteriore evidenza della presenza di cellule staminali adulte nelle ascidie deriva da studi condotti sulla linea neurale che hanno dimostrato la presenza di progenitori neurali capaci di rigenerare il cervello in seguito ad asportazione (Bollner et al, 2009). In B. schlosseri, inoltre, si pensa siano presenti pool di cellule staminali longeve che permettono, durante il ciclo blastogenetico, la formazione del complesso neurale nelle nuove gemme (Tiozzo et al, 2009). La presenza di una riproduzione sessuata e asessuata nell’ascidia coloniale B. schlosseri, permette di comparare il processo di neurogenesi in due distinti meccanismi di sviluppo: embriogenesi e blastogenesi. Al fine di chiarire i processi di emopoiesi e neurogenesi durante il ciclo blastogenetico, ho effettuato una ricerca di geni/trascritti di marcatori molecolari di cellule staminali emopoietiche e neurali dei vertebrati da utilizzare per la ricerca di sequenze ortologhe nel genoma e nel trascrittoma di B. schlosseri. Una volta individuate queste sequenze, dopo la loro traduzione in silico, ho effettuato una ricostruzione filogenetica che, per tutti i trascritti considerati ha restituito un albero in cui gli Urocordati sono compresi in un cluster che risulta sister group dei Vertebrati. I quattro marcatori usati per l’identificazione dei progenitori emopoietici in B. schlosseri, ortologhi ai geni trovati nei mammiferi, sono bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3 e bsgata4/5/6. L’ibridazione in situ, effettuata mediante specifiche ribo-sonde, su strisci di emociti e su sezioni di colonie, ha permesso di osservare la presenza dei trascritti emopoietici nelle lacune emolinfatiche della regione sub-endostilare. Questi risultati coincidono con le precedenti analisi morfologiche che identificano l’endostilo come nicchia di staminalità e rinforzano l’idea che bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3, bsgata4/5/6 siano anch’essi marcatori di staminalità emopoietica in B. schlosseri. Con la real time-PCR si osserva un’elevata espressione dei suddetti geni nella fase di mid-cycle del ciclo blastogenetico. Durante questa fase si ha la formazione delle gemme secondarie a partire da un ispessimento della parete della gemma primaria. L’elevato livello di espressione di bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3 e bsgata4/5/6 nel mid-cycle può essere pertanto messo in relazione con gli eventi di proliferazione e differenziamento di cellule staminali, necessari per la formazione dei tessuti della nuova generazione blastogenetica. Per la linea neurale, ho identificato e caratterizzato due trascritti ortologhi a Sox2 e Msi2 coinvolti nel riconoscimento di precursori neurali nei vertebrati ed ho indagato, inoltre, l’espressione, durante il ciclo blastogenetico, di un pannello di geni coinvolti nello sviluppo del sistema nervoso della larva delle ascidie (bspax2/5/8, bshox1 e bshox3). L’ISH con specifiche ribo-sonde per BsSox2, BsMsi2, BsPax2/5/8, BsHox1 e BsHox3 ha mostrato una marcatura comune nella nicchia endostilare e nella regione di formazione degli stigmi nel cestello branchiale della gemma primaria. Come osservato per i marcatori dei precursori emopoietici, la presenza dei trascritti di bssox2, bsmsi2, bspax2/5/8, bshox1 e bshox3 nella regione identificata come nicchia di staminalità, ci permette di concludere che le sonde dei trascritti considerati identificano precursori staminali e che, probabilmente, in B. schlosseri sono presenti dei precursori staminali pluripotenti in grado di differenziare in progenitori emopoietici o neurali in base ai segnali ricevuti. La real time-PCR mostra un elevato livello di trascrizione di questi geni nella fase di mid-cycle. Ricordando che in questa fase si sviluppano le gemme secondarie a partire dall’ispessimento della parete delle gemme primarie, la proliferazione di cellule staminali al fine di permettere la formazione di cellule neurali, necessarie per la formazione del primordio della ghiandola neurale e del ganglio cerebrale della nuova gemma, è fenomeno indispensabile. L’aumento di espressione di bssox2, bsmsi2, bspax2/5/8, bshox1 e bshox3 nella fase in cui si sa avvenire la formazione del nuovo sistema nervoso della gemma supporta la validità di queste molecole nell’identificazione dei precursori neurali. In aggiunta a questo importante ruolo, i marcatori emopoietici e neurali considerati, rivestono probabilmente ulteriori funzioni nei tessuti di B. schlosseri come evidenziato dalla presenza di marcature aggiuntive (ovociti, tessuti di gemme primarie e secondarie, cellule morulari). Quest’ulteriore aspetto verrà approfondito in studi successivi