In vitro and in vivo antitumor activity of new choline kinase inhibitor: a pharmacological strategy for breast cancer and leukemia treatment.

Aberrant choline metabolism is a feature shared by many tumors. It is predominantly caused by elevated expression and activation of choline kinase alpha (ChoKα), which catalyzes the phosphorylation of choline to phosphocholine in the Kennedy’s pathway for membrane lipids synthesis. In this PhD thesis, the most promising symmetrical ChoKα inhibitor has been identified from the novel series of choline kinase inhibitors, designed and synthesized by Prof. Lopez-Cara’s group, University of Granada, Spain. The therapeutic potential of the selected lead compound was compared to previously reported symmetrical ChoKα inhibitors and evaluated in two different tumoral contexts. Furthermore, the new ChoKα inhibitor was used to investigate for the first time choline metabolism deregulation in hematological tumors. The ChoKα inhibitor EB-3D (also known as compound 10a) was selected as lead compound. The crystal structure of ChoKα1 in complex with compound EB-3D (PDB ID: 5FTG) reveals that the compound effectively binds to the choline-binding site and inhibits ChoKα1 with IC50 of 1.00 ± 0.01 μM. EB-3D strongly inhibits cell growth in a panel of cancer cell lines with GI50 ranging from 27 to 110 nM for solid tumors and from 0.9 to 479 nM for hematological tumors. EB-3D inhibits also the formation of phosphocholine and reduces the content of choline-containg metabolites in treated cells. In triple-negative MDA-MB-231 breast cancer cells, EB-3D arrests cells in the G0/G1 phase of the cell cycle triggering irreversible cellular senescence. Moreover, EB-3D potentiates the antitumoral effect of cisplatin and impairs migration and invasiveness of the higly metastatic MDA-MB-231 cell line. Lastly, treatment of syngeneic orthotopic EO771- C57BL/6 mouse model with 1mg/kg of EB-3D i.p. resulted in strong tumour growth inhibition and reduction of metastasis formation. Alltogether, these data reveal the antitumorigenic and antimetastatic potential of EB-3D in triple-negative breast cancer (TNBC). T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cell lines exhibit increased levels of ChoKα compared to healthy lymphocytes and higher ChoKα/β ratio. EB-3D induces G0/G1 cell cycle arrest in T-ALL and, in contrast to breast cancer cells, induces cell death by apoptosis. The effect is rapidly triggered and cannot be rescued by compound withdrawal. EB-3D modulates the AMPK-mTOR pathway leading to the inactivation of final effectors required for protein synthesis and cell cycle progression. On the contrary, the effect appears attenuated in normal lymphocytes where other signaling pathways are involved. Finally, EB-3D strongly synergizes with L-asparaginase lowering the GI50 and increasing cell death. Taken together, these data validate ChoKα as a novel attractive therapeutic target in T-ALL and justify the further development of EB-3D inhibitor.L’enzima colina chinasi α (ChoKα) catalizza la fosforilazione della colina in fosfocolina nel primo step del Kennedy pathway che porta alla biosintesi dei fosfolipidi di membrana. Negli ultimi anni l’overespressione e/o iperattivazione dell’enzima ChoKα sono state descritte in diverse neoplasie, dove correlano con una peggior prognosi oltre che ad un’aumentata invasività e resistenza alle comuni terapie oncologiche. Dunque, per la sua rilevanza in campo oncologico, quest’enzima è recentemente diventato oggetto di interesse per lo sviluppo di inibitori selettivi. In questa tesi di Dottorato viene identificato l’inibitore simmetrico di ChoKα più promettente all’interno di una serie di nuovi composti disegnati e sintetizzati dal gruppo della Prof.ssa Lopez-Cara dell’Università di Granada, Spagna. Il potenziale terapeutico del composto selezionato è stato comparato con i due inibitori simmetrici di ChoKα di riferimento descritti in letteratura e valutato in due diversi contesti tumorali. Inoltre, il nuovo inibitore di ChoKα è stato usato per descrivere per la prima volta l’alterato metabolismo della colina nei tumori ematologici. Il composto EB-3D (riportato anche con il nome di composto 10a) è stato selezionato come migliore inibitore simmetrico di ChoKα. La struttura cristallografica di EB-3D in complesso con l’isoforma ChoKα1 (PDB ID: 5FTG) rivela che il composto si colloca nella tasca contenente il sito di legame della colina inibendo così ChoKα1 con IC50 di 1.00 ± 0.01 μM. EB-3D riduce drasticamente la proliferazione cellulare in un pannello di linee tumorali con GI50 che variano da 27 a 110 nM per i tumori solidi e da 0.9 a 479 nM per i tumori ematologici. EB-3D inoltre inibisce la formazione di fosfocolina e, in generale, riduce la quantità dei composti contenenti colina nelle cellule trattate. Nella linea cellulare di tumore mammario triplo negativo MDA-MB-231, EB-3D induce un blocco del ciclo cellulare nella fase G0/G1 innescando il processo della senescenza cellulare. EB-3D inoltre potenzia l’effetto antitumorale del cisplatino e interferisce sia sulla migrazione che sull’invasione di questa linea cellulare altamente metastatica. Infine, la somministrazione per via intraperitoneale di EB-3D nel modello murino singenico ortotopico EO771-C57BL/6 ha portato ad una significativa riduzione della massa tumorale e alla riduzione della formazione di metastasi polmonari. Complessivamente, questi dati rivelano il potenziale antitumorale e antimetastastico del nuovo inibitore di ChoKα EB-3D nella forma più aggressive di tumore al seno. Parallelamente, in questa tesi viene descritto per la prima volta che diverse linee cellulari di leucemia linfoblastica acuta di tipo T (T-ALL) esibiscono elevati livelli di ChoKα rispetto ai linfociti sani. EB-3D induce anche in questo caso l’arresto del ciclo cellulare in fase G0/G1 e, contrariamente a quanto osservato nelle cellule di tumore mammario, innesca l’apoptosi in modo rapido e irreversibile. EB-3D modula inoltre il pathway di AMPK-mTOR portando all’inattivazione degli effettori finali coinvolti nella sintesi proteica e nella progressione del ciclo cellulare. Infine, EB-3D sinergizza con L-asparaginasi, con incremento dell’apoptosi cellulare. Concludendo, questi risultati dimostrano che ChoKα può essere considerato un nuovo target terapeutico per le leucemie acute linfoblastiche e giustificano l’ulteriore sviluppo dell’inibitore EB-3D