Deregulated FGF signaling substantially contributes to early osteogenic defects in Mucopolysaccharidosis type II

FGF signaling is a key pathway strictly involved in many stages of ossification and gain of function mutations of many FGF pathway components have been associated with bone diseases like craniosynostosis and chondrodysplasia. The fine-tuning of the FGF signaling pathway is achieved at different levels, both intracellularly and by extracellular glycosaminoglycans (GAGs), which play a critical role in ligand and receptor binding. In this work, I show that the deficiency of iduronate 2-sulfatase (IDS), which is involved in GAGs catabolism, perturbs FGF signaling leading to early bone defects before the onset of evident massive GAGs storage. A defective IDS activity causes a rare lysosomal storage disease called Mucopolysaccharidosis type II, in which skeletal abnormalities represent one of the major disabling aspects. Enzyme replacement therapy (ERT) is the currently available therapeutic option, which, however, suffer from limited efficacy. To better elucidate early alterations of bone development occurring in MPSII, I took advantage of the zebrafish model, given its easy genetic manipulation and the evolutionary conserved mechanisms and signaling pathways regulating bone formation. In particular, I generated zebrafish models for MPSII, using a morpholino-based knock down technology and CRISPR/Cas9 technique, respectively. Using different approaches, including in situ hybridization and transgenesis, I demonstrated that the altered IDS function affects the expression of key FGF signaling markers and bone differentiation markers at early life stages, before any massive glycosaminoglycans accumulation is detectable. The involvement of the FGF signaling downstream to the IDS loss of function was also detected in cranial and appendicular bones of IDS knockout mice and in Hunter patient fibroblasts. Therefore, the results of this study suggest that in MPSII an early FGF signaling impairment, due to IDS deficit, may cause a dysregulated expression of genes involved in bone development before the occurrence of lysosomal GAGs accumulation.La via di segnale FGF è una importante pathway coinvolta in diverse fasi dell’osteogenesi e mutazioni che colpiscono componenti di questa via sono associate a diverse malattie umane come le craniosinostosi e le condrodisplasie. La regolazione della via di segnale FGF avviene a diversi livelli, sia con meccanismi intracellulari che tramite l’interazione con i glicosaminoglicani (GAGs) presenti nella matrice extracellulare, i quali possiedono un ruolo critico nell’interazione fra ligando e recettore. In questo lavoro viene dimostrato che alterazioni nella funzionalità dell’enzima iduronato 2-sulfatasi (IDS), coinvolto nel catabolismo dei GAGs, sono responsabili dell’alterazione della via di segnale FGF. La mancata o deficitaria attività dell’enzima IDS è causa dell’insorgenza di una rara patologia da accumulo lisosomiale chiamata Mucopolisaccaridosi di tipo II, nella quale uno degli aspetti più disabilitanti è rappresentato da manifestazioni patologiche dell’apparato scheletrico. La terapia comunemente impiegata è la somministrazione dell’enzima ricombinante (Enzyme Replacement Therapy, ERT) che, pur determinando un miglioramento di una parte della sintomatologia, non risulta efficace, o comunque risulta scarsamente efficace, in distretti importanti come cuore e sistema scheletrico. Per lo studio della patogenesi molecolare della MPSII e la comprensione dei meccanismi patogenetici che inducono alterazioni precoci nello sviluppo osseo, è stato utilizzato lo zebrafish come modello. Zebrafish risulta infatti un buon modello perché semplice da manipolare geneticamente; inoltre, in esso, il controllo delle principali vie di segnale che regolano il suo sviluppo osseo è altamente conservato. Sono stati generati sia modelli transienti con l’utilizzo della tecnica oligo morfolino, sia un mutante stabile applicando il metodo Crispr/Cas9. Utilizzando diversi approcci sperimentali, comprese tecniche di ibridazione in situ e transgenesi, è stato dimostrato che la mancata funzionalità dell’IDS determina alterazioni nell’espressione di marcatori chiave della via di segnale FGF e della differenziazione ossea a stadi molto precoci, prima di un evidente accumulo di glicosaminoglicani nei tessuti. L’alterazione di questa pathway è stata osservata anche in campioni di ossa craniche e appendicolari di topi IDS-KO e in fibroblasti di pazienti Hunter. I risultati di questo studio suggeriscono dunque che nella MPSII disfunzioni dell’enzima IDS inducano, in fasi precoci, alterazioni nella regolazione della via di segnale FGF, che a loro volta possono essere responsabili dell’alterata espressione di geni coinvolti nello sviluppo osseo, prima che si verifichi l’accumulo dei GAGs nei lisosomi