Caratterizzazione e valutazione delle potenzialità di impiego di batteri lattici in campo enologico

ABSTRACT This PhD work was developed within a project which aims to discover the biodiversity of the microorganisms inhabiting the grape pomace devoted to grappa production, with special regards to bacteria and yeasts. The experimental plan was set up to analyze bacterial dynamics during grape pomace ensilage, and to test the effect of some technological treatments performed by some distilleries in order to control the development of the microflora . Bacterial microflora could let to contamination and affect negatively the quality of the final product, to date no scientific informations are available regarding the bacterial population inhabiting Italian grape pomace, by the way, bacteria are thought to produce off flavours during the ensilage of the raw material. In this work we have tested the refrigeration treatment, acidification and yeast inoculation in the Prosecco grape pomace. A combination of classical microbiological and molecular methods has been employed to investigate the dynamics of the bacterial microflora present in grape pomace during a 6 months period of ensilage. The acidification of the vegetal matrix led to the inhibition of the bacterial growth, comparing to the not treated grape pomace, where bacteria reached high concentration after 30 days of storage and until the end of the experiment. This technological practice could be applied by distilleries in order to control the bacterial development. In the next step of the work, bacterial strains isolated from not treated and acidified grape pomace, have been analyzed by genetical methods, in order to identify species composition. The higher biodiversity was recovered at the beginning of the experiment, when aerobic bacteria and lactic acid bacteria were isolated, all of them are typical species present on the berry surface. During grape pomace ensilage, the population changes and lactic acid bacteria are the only microorganism isolated, in particular L.plantarum specie is dominant during the whole storage period and can be considered the typical grape pomace bacteria. The acidification treatment led to a strong species shift: the only species isolated was in fact O.oeni, a lactic acid bacteria with a strong adaptation to harsh an acidic environment. L.plantarum and O.oeni populations have been further analyzed by molecular typing, in order to better characterize the most abundant species present in the grape pomace. Results show a high genetic biodiversity among both populations, with many unique individual which are present only in one sampling time, thus demonstrating a strong change in the population composition during the ensilage. The last part of the work focused on L.plantarum population, and aimed to better characterize its physiological properties. A total of 41 strains have been screened for the antibacterial activity and biofilm formation. These features could be important for the adaptation and colonization of L.plantarum in the grape pomace environment . None of the strains has shown a relevant antibacterial activity in vitro, but many of them showed the ability to form biofilm, especially when in combination with a S.cerevisiae strain, the most abundant yeast species in grape pomace. This result suggests an important role of biofilm formation on grape pomace as a mechanism by which microorganisms can colonize this solid matrix and survive this harsh environment.RIASSUNTO Questo lavoro di tesi si inserisce nell’ambito di un ampio progetto che prevede lo studio del comportamento delle popolazioni microbiche (lieviti e batteri) presenti nella vinaccia destinata alla produzione di grappa durante le fasi critiche di stoccaggio. La sperimentazione allestita ha previsto l’analisi dell’effetto di alcune metodiche di conservazione della vinaccia in uso nelle distillerie più moderne per impedire lo sviluppo incontrollato della flora batterica, in particolar modo dei batteri che possono produrre composti con effetto negativo sulla qualità del distillato. A tutt’oggi non vi sono però evidenze scientifiche del ruolo effettivo della componente microbica nella vinaccia italiana, ne’ dell’effetto di trattamenti tecnologici sulla microflora di questa materia prima. In questo lavoro è stata studiata la vinaccia di uva Prosecco, una varietà tipica della Regione Veneto; sono state sperimentate la refrigerazione della vinaccia durante il tragitto alla distilleria, mentre in fase di conservazione è stata sperimentata la acidificazione e l’inoculo di un ceppo commerciale di lievito. Mediante metodi microbiologici classici e metodi molecolari, è stato possibile valutare quantitativamente la microflora batterica e seguirne l’andamento dall’inizio dell’insilamento fino a 180 giorni di stoccaggio. Tra i trattamenti tecnologici sperimentati, l’acidificazione ha prodotto un rilevante effetto di rallentamento della crescita microbica, confermando il possibile utilizzo di questa metodica da parte delle distillerie per controllare lo sviluppo dei batteri durante l’insilamento della vinaccia. Nella vinaccia non trattata la carica microbica ha raggiunto il valore massimo a 30 giorni di insilamento, e si è attestata su valori elevati per tutta la durata della sperimentazione. Nella successiva fase del lavoro i batteri isolati da vinaccia naturale e acidificata a 0-30-120 giorni di insilamento, sono stati sottoposti ad analisi genetiche che hanno consentito di identificare le specie batteriche presenti in vinaccia e capire come esse evolvono naturalmente durante l’insilamento. Una notevole biodiversità è stata riscontrata all’inizio della fase di stoccaggio della vinaccia, le specie batteriche isolate corrispondono a quelle presenti sulla bacca in vigneto, trattandosi infatti prevalentemente di specie di batteri aerobi e anche di specie di batteri lattici tipicamente presenti sulla superficie dell’uva. Nelle fasi successive dell’insilamento della vinaccia, la microflora evolve e si ritrovano unicamente i batteri lattici, in particolare la specie L.plantarum che può essere considerata dai risultati di questo lavoro, la specie tipica della vinaccia di Prosecco. Il trattamento di acidificazione ha dimostrato un rilevante effetto oltre che quantitativo, anche sulla composizione della microflora, infatti in vinaccia acidificata è stato isolata solo la specie O.oeni: un batterio lattico che è in grado di adattarsi meglio degli altri ad ambienti acidi. Gli isolati appartenenti alle specie L.plantarum e O.oeni sono stati poi sottoposti a una tipizzazione allo scopo di caratterizzare geneticamente a livello di ceppo le popolazioni batteriche prevalenti in vinaccia. E’ stata osservata una notevole biodiversità di entrambe le popolazioni, con la presenza di moltissimi individui con caratteristiche genetiche uniche, inoltre per entrambe le specie si assiste a una successione di popolazioni nel corso dell’insilamento, con la maggior parte degli individui che si ritrova solo in un tempo di campionamento. Nell’ultima parte del lavoro è stato effettuato uno screening per valutare alcune caratteristiche fisiologiche della popolazione L.plantarum. Da tutti gli isolati analizzati a livello di ceppo, ne sono stati scelti 41 in base alla loro distanza genetica e al tempo di campionamento, per questi sono state indagate l’attività antimicrobica e la capacità di formare biofilm. Queste due caratteristiche sono comuni nelle popolazioni batteriche naturali e in particolare dei batteri lattici, spesso sono coinvolte nella colonizzazione di nuove nicchie ecologiche e possono essere considerate dei meccanismi con cui i batteri si adattano a un ambiente particolarmente ostico come la vinaccia. Nessun isolato di L.plantarum ha dimostrato attività antimicrobica nelle condizioni testate, mentre molti isolati si sono dimostrati in grado di produrre biofilm in vitro, soprattutto quando sono in combinazione con ceppi di lievito S.cerevisiae, anch’esso un microrganismo largamente presente nella vinaccia di Prosecco. La capacità di formare biofilm è quindi una proprietà caratteristica degli isolati di L.plantarum e potrebbe rivestire un ruolo importante nell’adattamento di questa specie all’ambiente vinaccia, permettendole di crescere e svilupparsi alla superficie della vinaccia, in associazione con gli altri microrganismi presenti, in particolar modo S.cerevisiae