Nanotechnologies for CNS drug delivery: therapy for the neurological compartment in the Mucopolisaccharidoses

Lysosomal storage disorders (LSDs) are a group of neurometabolic syndromes, mostly due to the deficit of one lysosomal enzyme. Many LSDs affect most of the organ systems and about two-thirds of the patients also present neurological and cognitive impairment. Enzyme replacement therapy, the most common therapeutic strategy applied to some LSDs, although determining some clinical improvements, has revealed to be ineffective on the CNS disease, due to enzymes' inability to cross the blood-brain barrier (BBB). So alternative methods to achieve transcytosis into the CNS need to be explored. Among LSDs, Mucopolysaccharidoses (MPS) are characterized by a totally or partially defective activity of lysosomal enzymes involved in the catabolism of the glycosaminoglycans (GAGs), which, therefore, heavily accumulate within cellular compartment and in the extracellular matrix. In this study, in which MPS type I and type II have been in particular evaluated, polymeric nanoparticles (NPs), modified with a glycopeptide of 7 amino acids (g7), already tested for the delivery of low molecular weight molecules, were tested as possible vehicle for BBB crossing and delivering of the therapeutic recombinant enzymes to the CNS after systemic administration in mice. Results obtained in preliminary studies in the MPS I and MPS II mouse models, clearly showed that g7-NPs are able to deliver the model drug FITC-albumin to the brain, by crossing the BBB, in all treated mice (Idua-ko, Ids-ko and wt). The subsequent in vivo preliminary study in the MPS II mouse model, using g7-NPs loaded with the recombinant IDS enzyme and labelled with Rhodamine B (g7-NPs-IDS-R), confirmed that g7-NPs can transport the enzyme through the BBB and paved the way for the upcoming in vitro and in vivo efficacy studies. In the in vitro study fibroblasts obtained from MPS II patients were treated with untargeted NPs (devoid of g7), loaded with the recombinant enzyme for MPS II. Data obtained suggested that nanoparticles may need more than 2 weeks to open up and release the recombinant enzyme or, otherwise, that they may need a more complex physiological system with respect to the in vitro one. To evaluate transfer efficiency and the enzymatic activity induced by g7-NPs loaded with the recombinant enzyme (g7-NPs-IDS), an in vivo pilot study in the MPS II mouse model was conducted. Mice were treated with a single dose of enzyme and sacrificed after 7 or 14 days. No induced IDS activity or reduction in GAG storage was, however, detected in liver and brain of g7-NPs-IDS treated mice. Although the results obtained in the in vitro and in vivo pilot studies were mostly negative, it was important to carry out a medium-term analysis to assess the possible opening of NPs in a longer time. To this aim, an in vivo study was conducted in the MPS II mouse model, by treating mice once a week for 6 weeks. Biochemical, histological, immunohistochemical and immunofluorescence evaluations, conducted in liver and brain of g7-NPs-IDS treated mice suggested that a period of 6 weeks is again too short to detect the opening of the NPs and the release of the encapsulated enzyme. However, results obtained from this medium-term study are encouraging as they show a slight trend towards improvement in brain and liver of g7-NPs-IDS treated mice. Further studies, at the moment ongoing, are needed to understand the timing of release of the enzyme from the NPs; in addition, we are re-formulating the nanoparticles with the aim to maintain the same transport efficiency to the CNS, although allowing a significant reduction of the timing of drug release.Le malattie da accumulo lisosomiale (LSD) sono un gruppo di patologie neurometaboliche, causate principalmente dal deficit di un enzima lisosomiale. Le LSD sono malattie multisistemiche e circa due terzi dei pazienti presentano anche danno neurologico e cognitivo. La terapia enzimatica sostitutiva, la strategia terapeutica più comunemente applicata ad alcune LSD, pur determinando alcuni miglioramenti sistemici, si è rivelata inefficace nel trattamento del coinvolgimento neurologico, a causa dell’incapacità degli enzimi terapeutici di attraversare la barriera emato-encefalica (BEE). Diventa, perciò, di primaria importanza valutare metodi alternativi per il trasporto di questi farmaci al sistema nervoso centrale (SNC). Tra le LSD, le Mucopolisaccaridosi (MPS) sono caratterizzate dalla mancanza totale o parziale di attività di enzimi lisosomiali coinvolti nel catabolismo dei glicosaminoglicani (GAG), che, pertanto, si accumulano sia nel comparto cellulare che nella matrice extracellulare. In questo studio, nel quale sono state in particolare studiate le MPS di tipo I e di tipo II, nanoparticelle polimeriche (NPs), modificate con un glicopeptide di 7 amminoacidi (g7), già testate per il trasporto oltre barriera di molecole a basso peso molecolare, sono state valutate come possibile veicolo per l’attraversamento della BEE e il trasporto degli enzimi terapeutici ricombinanti al SNC, dopo somministrazione sistemica nei topi. I risultati ottenuti negli studi preliminari nei modelli murini per la MPS I e la MPS II, hanno mostrato chiaramente che le g7-NPs sono in grado di trasportare al cervello l’albumina-FITC (farmaco modello), attraversando la BEE, in tutti i topi trattati (Ids-ko, Idua-ko e wt). Il successivo studio preliminare in vivo nel modello murino per la MPS II, in cui sono state testate le g7-NPs caricate con l’enzima IDS ricombinante e marcate con Rodamina B (g7-NPs-IDS-R), ha confermato che le g7-NPs sono in grado di trasportare l’enzima attraverso la BEE, aprendo così la strada per i successivi studi di efficacia da effettuare in vitro ed in vivo. Nello studio in vitro, fibroblasti ottenuti da pazienti affetti da MPS II sono stati trattati con NPs non targettate (prive di g7) e caricate con l’enzima ricombinante impiegato per la terapia di questa patologia. I dati ottenuti hanno suggerito che le nanoparticelle probabilmente necessitano di un tempo superiore alle 2 settimane per aprirsi e rilasciare l’enzima ricombinante o, anche, che le fasi di apertura e rilascio potrebbero necessitare di un sistema fisiologico più complesso rispetto ad un sistema in vitro. Per valutare l'efficienza di trasferimento e l'attività enzimatica indotta dalle g7-NPs caricate con l'enzima ricombinante (g7-NPs-IDS), è stato di seguito condotto uno studio pilota in vivo nel modello murino per la MPS II. I topi sono stati trattati con una singola dose di enzima e sacrificati dopo 7 o 14 giorni. Nel fegato e nel cervello dei topi trattati con g7-NPs-IDS non è stata, tuttavia, rilevata alcuna attività IDS indotta o la riduzione dei depositi di GAG. Sebbene i risultati ottenuti dallo studio in vitro e da quello pilota in vivo risultassero per lo più negativi, era importante effettuare un’analisi a medio termine per valutare l’eventuale apertura delle NPs in un tempo più lungo. A questo scopo, è stato condotto uno studio in vivo nel modello murino per la MPS II, mediante somministrazione settimanale di NPs nei topi, per un totale di 6 settimane. Le valutazioni biochimiche, istologiche, immunoistochimiche e di immunofluorescenza condotte nel fegato e nel cervello dei topi trattati con le g7-NPs-IDS hanno evidenziato che un periodo di 6 settimane di trattamento è ancora insufficiente per consentire un'efficace apertura delle NPs e il rilascio dell’enzima incapsulato. Tuttavia, i risultati ottenuti da questo ultimo studio a medio termine sono risultati incoraggianti, poiché mostrano una costante, se pur lieve, tendenza al miglioramento nel fegato e nel cervello dei topi trattati con g7-NPs-IDS. Ulteriori studi sono necessari, e sono attualmente in corso, per capire i tempi di rilascio dell’enzima dalle NPs; inoltre, è in fase di rivalutazione la formulazione delle stesse, con l'obiettivo di mantenerne l'efficienza di trasporto al SNC, ma di ridurne i tempi di rilascio del farmaco