Ricostruzione della parete addominale con scaffold decellularizzati studio sperimentale

BACKGROUND Research efforts are been directed in the last few years on tissue- engineering and the possibility of tissue creation by laboratory device. In fact biochemistry, immunology and experimental surgery has been provided new solutions for organs transplant or anatomical structure replacement. Variously method were described to obtain decelullarized matrix from organ or part of them, and how that bioengineered scaffolds can be integrated into recipient organism. The aim of the studies is to provide a source, from animal or cadaver, of engineered organs or tissue flaps available from transplant or reconstructive surgery, free from infective disease, completely functional and without rejection phenomenon. AIM OF THE STUDY The aim of this study is to investigate the bio integration potential of a tissue engineered abdominal wall obtained from a donor, even after a protocol of decellularization than after recellularization with stem cell of recipient, obtained from adipose tissue, in vitro and microsurgical transfer in vivo, in order to create a biocompatible free flap without rejection phenomenon (omo-autologous flap). Similarly a sample of decellularized muscle are transferred to a recipient and histological and sonographic result were evaluated. MATERIAL AND METHODS Samples of the abdominal wall were collected with iliac arterial and vein pedicle as a free flap from rabbits, before sacrifice (donor). At the same time a sample of adipose tissue was collected from a different rabbit (recipient). The abdominal wall samples underwent a 7 days decellularization protocol. Small samples of the tissues were collected before and after that procedure for histological evaluation of the process. The adipose tissue sample of the recipient were treated to obtain a full rich stem cells tissue. Similar sample of muscle without vessel are collected and underwent a decellularization protocol and so on for major vessel sample with a specific one for vascular tissue. A decellularized muscle patch are implanted in vivo and rejection phenomenon, survival of the patch and herniation presence were observed after three weeks even by sonography than by histological evaluation after sacrifice. RESULTS The histological evaluations shown a progressive degeneration and loss of cellular content of the rabbit abdominal wall samples. In parallel, the general ECM structure maintain their staining properties. Particularly relevant is the preservation of vascular channels. Muscle decellularized sample implanted in vivo demonstrated good biointegration at sonography exam and no herniation was observed; histologic evaluation demonstrated presence of limitated granulomatosis reaction , numerously vessels and conservation of original muscle architecture, substituted by fibrosis,without evident rejection. Histological and moreover evaluation of free flap transplant, stem cells seeding and vessel decellularization are in process. CONCLUSION Decellularized muscle patch provide the evidence of a new bioingeneered tissue that could be useful for abdominal wall repair or reconstruction. Biointegration could be improve by use of stem cells and growth factor seeding. Similarly the demonstration of the preservation of the vascular network and extra cellular matrix of abdominal wall sample provide the possibilities of being bio integrated after vascular anastomoses that is the aim of the studies actually on goingPRESUPPOSTI DELLO STUDIO La ricerca per ottenere un tessuto o un intero organo bioingegnerizzato è attualmente la più intensa e foriera di speranze nel campo della trapiantologia e della traumatologia, che devono fronteggiare la scarsa disponibilità di organi e tessuti omologhi, le problematiche legate al rigetto e l’inevitabile comorbidità qualora si ricorra al prelievo di tessuti autologhi. La bioingegneria dei tessuti è quella branca nata dalla fusione di diverse esperienze in campo biomolecolare, immunologico, anatomico e di chirurgia sperimentale volto ad ottenere la possibilità di utilizzare nell’uomo organi e tessuti ottenuti in laboratorio a partenza da materiale biologico. Ad oggi una delle maggiori limitazioni al raggiungimento di tale scopo è rappresentata dalla difficoltà di ottenere un costrutto con un’adeguata architettura vascolare al suo interno, tale da permetterne la sopravvivenza una volta impiantato in vivo. Per superare tale limitazione si è cercato di ottenere in laboratorio delle strutture che fungessero da impalcature, i cosiddetti “ scaffold”, in grado di favorire la crescita cellulare ordinata , ottenendo un tessuto bioingegnerizzato. Le prime osservazioni vennero fatte mediante l’impiego di costrutti costituiti da materiali di sintesi ma successivamente i risultati più incoraggianti si sono verificati grazie all’impiego di scaffold biologici ottenuti attraverso il procedimento noto come “decelullarizzazione” . Tale procedura, con aspetti tecnici diversificati per tipologia di tessuto, permette di eliminare le cellule, fonte di incompatibilità nei trapianti, mantenendo la citoarchiettura nativa ove è possibile promuovere e guidare un processo di neoangiogenesi e susseguente rivascolarizzazione una volta impiantati in vivo. Alternativamente si è studiata la possibilità di sviluppare scaffold con una rete vascolare preformata al loro interno, ma nessun tentativo è stato fatto di provvedere una rivascolarizzazione diretta nell’impianto in vivo. SCOPO DELLO STUDIO Questo studio pone le sue basi nella ricostruzione della parete addominale ottenuta mediante trapianto da cadavere nei casi di trapianto multiviscerale. Si è cercato di valutare la realizzabilità nel modello animale di ottenere un similare lembo microchirurgico miofasciale che potesse essere decellularizzato e trasferito su di un ricevente sia in questa forma che dopo averlo colonizzato con cellule staminali derivate dal tessuto adiposo del ricevente medesimo per aumentare l’immunocompatibilità ( lembo omo-autologo). Inoltre è stata studiata la ricostruzione della parete addominale mediante impianto di un patch muscolare decellularizzato. MATERIALI E METODI Sono stati prelevati mediante ingradimento al microscopio operatorio lembi del muscolo retto dell’addome dalla parete addominale di coniglio assieme al loro asse vascolare artero-venoso sino alle iliache e ,dopo il sacrificio dell’animale, sono stati sottoposti ad un protocollo di decellularizzazione della durata di 7 giorni, sviluppato adattandone uno per il tessuto muscolare pubblicato in letteratura. Identici campioni privi di asse vascolare sono stati prelevati e sottoposti alla medesima procedura mentre campioni di assi vascolari sono stati separatamente sottoposti a trattamento mediante protocollo per decelullarizzazione dei vasi. Sia prima che durante le fasi del processo sono stati eseguiti prelievi dei campioni tissutali ed eseguite multiple colorazioni istologiche al fine di verificare l’efficacia del procedimento. Sono stati altresì eseguiti prelievo di tessuto adiposo ed omento al fine di verificarne la cellularità e la possibilità di estrazione di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC). Un patch di tessuto muscolare decellularizzato è stato impiantato a riparo di una perdita di sostanza muscolare addominale a tutto spessore in un animale ricevente che, a distanza di 3 settiman,e è stato sottoposto a controllo ecografico e a prelievo dell’impianto , che veniva sottoposto ad analisi istologica a tre colorazioni. RISULTATI Il tessuto muscolare dopo decellularizzazione dimostra una mancanza di nuclei e di fibre muscolari mantenendo integra la matrice extracellulare e la struttura dei canali vascolari, di cui rimangono apprezzabili i diversi strati delle pareti, compresi gli strati di fibre elastiche. L’analisi della decellularizzazione dei vasi maggiori è tuttora in corso. L’impianto muscolare eseguito ha dimostrato all’ecografia stabilità, assenza di fenomeni di rigetto e ricostituzione della contenzione dei visceri addominali con assenza di erniazione. L’esame istologico presenta un ricco pattern vascolare con presenza non diffusa da parte di cellule infiammatorie ( reazione granulomatosa) mantenendo l’architettura originale delle fibre muscolari occupate per la maggior parte da processo fibrotico. CONCLUSIONI La decellularizzazione del tessuto muscolare ed il suo impianto in vivo hanno permesso di identificare una struttura biologica in grado di offrire una valida alternativa ai materiali attualmente impiegati per la riparazione delle erniazioni addominali. Ulteriori valutazioni andranno fatte sulla possibilità di aumentarne le chance di biointegrazione mediante inserimento di cellule staminali del ricevente e fattori di crescita . Parimenti i processi di decellularizzazione del lembo e del suo asse vascolare, con e senza impianto staminale, sono tutt’ora in corso per poterne verificare la fattibilità ed i risultati di un trasferimento microchirurgic