Evaluation of the neuroprotective effect of parkin in a a-synuclein-based rat model of Parkinson's disease

Parkinson’s disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder, characterized by progressive loss of nigrostriatal dopaminergic neurons and a reduction in striatal dopamine concentration. Different causal genes linked to rare familial forms of PD have been identified, while late-onset idiopathic PD is thought to result from the interplay between predisposing genes and environmental factors. Two missense mutations (A53T and A30P) in the α-synuclein (α-syn) gene have received great attention with the discovery that abnormal metabolism and accumulation of α-syn in dopaminergic neurons leads to both forms of PD. Parkin functions as an E3 ubiquitin ligase involved in the cellular machinery that tags proteins with ubiquitin, thereby targeting them for degradation by the proteasome: loss of its activity seems to cause an autosomal recessive form of PD. The ubiquitin-proteasome system plays a major role in many vital cellular processes, and its dysfunction has been implicated in the pathogenesis of neurodegenerative disorders. A number of observations suggest that functional interaction between α-syn and parkin may involve the proteasome: α-syn interacts with and may be degraded by the proteasome, over-expression of α-syn inhibits the proteasome and mutant α-syn increases the sensitivity of cells to proteasome inhibition. We described previously a hemi-parkinsonian rat model based on the stereotaxic injection of TAT-α-syn-A30P in the right substantia nigra pars compacta (SNpc). The protein transduction domain derived from the human immunodeficiency virus-1 TAT (transactivator) protein sequence allows diffusion of the fusion protein across the neuronal plasma membrane and results in a localized dopaminergic cell loss. Here we examined possible neuroprotective effects of TAT-parkin against α-syn-induced neurotoxicity. Rats were stereotaxically injected with TAT-α-syn A30P, TAT-parkin, or both. At different times animals were subjected to different behavioral tests and the brains processed for immunohistochemical analysis. The behavioral tests showed a impairment in motor function after TAT-α-syn A30P, TAT-parkin or their combination, and postural asymmetry in all treated groups compared to control animals. Immuohistochemical analysis showed that the most severe depletion occurs in TAT-α-syn A30P + TAT-parkin treated animals, compared to control animals. Next, animals received an intra-nigral injection of different doses of TAT-parkin to evaluate a possible dose-dependent toxicity of TAT-parkin. Damage was again assessed using two behavioral tests, and showed variable impairments in motor function indicating that only the group receiving the lowest TAT-parkin dose is devoid of a toxic effect. All animals were subjected also to in vivo microdialysis to monitor striatal dopamine release; microdialysis samples were analyzed by HPLC and showed an increase in dopamine release after stimulation with nicotine. Immunohistochemical analysis revealed tissue damage as a significant loss of dopaminergic neurons in the SNpc: only animals receiving the lowest dose of TAT-parkin have a less severe damage compared to control animals. In the last experiment we examined the possible neuroprotective effect of a non-toxic dose of TAT-parkin against a 50% higher dose of TAT-α-syn A30P. Behavioral testing revealed motor function impairment among all treated groups, but the highest TAT-parkin dose seems to ameliorate it better than lower doses. The microdialysis experiment confirms that the two doses of TAT-parkin stimulate the release of DA, and shows an increase in dopamine level even in groups with TAT-α-syn A30P lesion, especially with the lowest dose of TAT-parkin. Immunohistochemical analysis revealed an increase in dopaminergic fiber optical density when TAT-parkin is used with a higher dose of TAT-α-syn A30P. The α-syn-parkin-based model reproduces the pathophysiology of PD and could be of utility to understand the mechanisms leading to dopaminergic neurodegeneration, thereby helping to identify disease-modifying strategies as opposed to therapies which provide only symptomatic reliefIl morbo di Parkinson è una patologia neurodegenerative del sistema nervoso centrale dovuta alla progressiva perdita dei neuroni dopaminergici della sub stantia nigra pars compacta (SNpc), e dalla presenza di inclusioni intracellulari, denominate corpi di Lewy, nei restanti neuroni. La diagnosi clinica di morbo di Parkinson viene effettuata in presenza di rigidità muscolare, bradicinesia e tremore a riposo, a cui vengono aggiunti una serie di sintomi secondari, quali l’alterazione della postura, disfunzioni cognitive (demenza, psicosi) ed alterazioni dell’umore (depressione, ansia, anedonia). L’eziopatogenesi rimane tuttora sconosciuta, anche se evidenze sperimentali suggeriscono che molteplici fattori, soprattutto di tipo genetico ed ambientale, possono contribuire al suo sviluppo. Nonostante sia solo una ristretta minoranza di persone ad essere colpita da forme di Parkinson familiare, si stanno studiando i meccanismi genetici che stanno alla base di questi casi, nella speranza di individuare i meccanismi patogenetici responsabili di tutte le forme di Parkinson, questo perché le più recenti evidenze scientifiche hanno attribuito alla α-sinucleina (α-syn) un ruolo chiave nell’insorgenza e nel progressivo peggioramento della malattia, sia di tipo idiopatico che genetico. Due mutazioni puntiformi (A30P e A53T) di questa proteina, infatti, portano a due varianti ereditarie di Parkinson di tipo autosomico dominante, inoltre l’α-syn è altamente espressa nei corpi di Lewy, tipicamente riscontrati nei pazienti affetti da Parkinson idiopatico. L’α-syn è una proteina presinaptica la cui funzione fisiologica è ancora poco chiara. Le ipotesi più accreditate suggeriscono un suo ruolo nel coinvolgimento nei processi di plasticità sinaptica, accumulo e rilascio di neurotrasmettitori in vescicole. Per quanto concerne la sua capacità di promuovere la neurodegenerazione, è ormai accertato che diversi fattori possono indurre una sua modifica conformazionale portandola da uno stato solubile ad uno fibrillare insolubile, quest’ultimo responsabile della tossicità. La parkina è una E3-ubiquitina ligasi coinvolta nei processi di degradazione di proteine danneggiate o mal ripiegate mediante l’interazione con il complesso proteasomico. La perdita di questa funzione da parte della parkina, conseguente a mutazioni o a stress ossidativo, sembra costruire il meccanismo patogenetico del Parkinson giovanile, portando ad un accumulo delle proteine ed alla disregolazione del metabolismo della dopamina. In questo contesto è rilevante notare che recenti studi hanno evidenziato che l’α-syn potrebbe essere un substrato della parkina e che quest’ultima possa avere un ruolo protettivo nella sopravvivenza dei neuroni dopaminergici nigrali. Alla luce di queste ultime evidenze, il progetto di ricerca ha avuto lo scopo di indagare il potenziale effetto neuro protettivo della parkina nel modello animale di Parkinson basato sull’iniezione intra nigrale unilaterale dell’α-syn A30P attaccata ad una sequenza di traslocazione cellulare TAT in grado di favorire la diffusione di macromolecole attraverso la membrana cellulare. Dopo la purificazione di TAT-α-syn A30P e di TAT-parkina, un primo gruppo di ratti ha ricevuto l’iniezione intra nigrale delle proteine singole o di entrambe. Il test comportamentale del RotaRod ha evidenziato una significativa riduzione della capacità motoria non solo nei due gruppi di animali che avevano ricevuto le due proteine singolarmente ma anche, contrariamente a quanto ipotizzato, anche nel gruppo che le aveva ricevute entrambe. Questo dato è stato in seguito confermato anche dall’analisi immunoistochimica condotta contro l’enzima tirosina idrossilasi (TH). Da questo primo esperimento è stato possibile notare come, l’effetto della TAT-parkina non risulta essere protettivo nei confronti del danno causato da TAT-α-syn A30P. Questo potrebbe essere causato dalla somministrazione di una dose eccessiva di TAT-parkina e a tal proposito è stato progettato un esperimento per testare le condizioni di somministrazione e le concentrazioni più opportune di TAT-parkina al fine di ottenere un effetto neuroprotettivo e non tossico. Sia il test comportamentale del RotaRod che l’analisi immunoistochimica hanno evidenziato una dipendenza della tossicità dalla dose, da cui emerge che la dose più bassa di TAT-parkina testata (0.0375 μg) abbia un effetto tossico inferiore rispetto alle altre dosi testate. Gli animali sono stati inoltre sottoposti a microdialisi cerebrale e dall’analisi dei dati è possibile notare come, a seguito della stimolazione con nicotina, gli animali iniettati con la TAT-parkina abbiano un progressivo aumento di rilascio di DA al diminuire della dose di proteina iniettata rispetto agli animali di controllo. Da questi risultati sembra che la dose più bassa di TAT-parkina abbia un effetto tossico inferiore rispetto alle altre dosi testate. A tal proposito è stato progettato un ulteriore esperimento per valutare un possibile effetto neuroprotettivo della TAT-parkina alla dose di 0.0375 µg nei confronti del danno causato da una dose di TAT-α-syn A30P del 50% superiore rispetto a quella usata nel primo esperimento. Gli animali sono stati divisi in 6 gruppi di trattamento ed hanno ricevuto o una dose di TAT-α-syn A30P del 50% superiore rispetto a quella testata precedentemente, o TAT-parkina (0.15 e 0.0375 µg) singolarmente o la combinazione di entrambe. I dati comportamentali sono risultati in accordo con quanto visto negli esperimenti precedenti, ovvero le proteine singolarmente hanno entrambe effetti tossici, mentre la capacità motoria migliora leggermente quando vengono entrambe iniettate. Dall’analisi dei dati di micro dialisi è emerso che, a seguito della stimolazione con nicotina, gli animali iniettati con la TAT-parkina evidenziano, in accordo con i risultati trovati in precedenza, un aumento di rilascio di DA al diminuire della dose di proteina iniettata rispetto agli animali di controllo. Gli animali lesionati con TAT-α-syn A30P sono caratterizzati da una diminuzione nel rilascio di DA, mentre gli animali che hanno ricevuto entrambe le proteine hanno due rilasci intermedi rispetto ai controlli ed ai trattati con TAT-parkina singolarmente. L’analisi immunoistochimica ha confermato la diminuzione della positività dopaminergica alla TH, nei gruppi di animali iniettati con le proteine singole, mentre ha messo in luce un aumento della stessa negli animali che avevano ricevuto entrambe le proteine. Complessivamente i dati ottenuti suggeriscono che vi possa essere una correlazione tra l’attività della parkina ed il grado di lesione causato da α-syn. Le caratteristiche di questo modello sperimentale potrebbero pertanto contribuire allo studio ed alla comprensione delle fasi iniziali della malattia di Parkinson ed allo sviluppo di nuove strategie terapeutich