Ingegneria Tissutale delle Valvole Cardiache: valutazione di metodi di decellularizzazione e semine cellulari su Pericardio Bovino e Porcino

BACKGROUND: In the western world the prevalence of valvular heart diseases in general population account for 2%, and is constantly increasing due to ageing phenomena of the population. Current surgical therapies imply the use of mechanical and biological valves for the replacement of the diseased valve. Unfortunately in the long term this substitute valves lead patients to complications or reoperations. By using Tissue Engineering (TE) technologis, a science that combines contributions from engineering and biology, it is being investigated whether it is possible to create a new viable valve substitute that, similarly to healthy human valves, can withstand in vivo mechanical stress and undergo remodelling and growth after implantation, especially in paediatric patients. AIM OF THE STUDY: The purposes of this study are: Understand efficacy of UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC decellularisation methods applied to Bovine Pericardium (BP), Calf Pericardium (CP) and Porcine Pericardium (PP), To test recellularisation potential of UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC BP, Physical and structural characterisation of CF and PP, before and after TRITDOC treatment. The obtained acellular scaffolds are considered as potential materials to be used for TE heart valve production. MATERIALS AND METHODS: BP has been decellularized using three methods: UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC. Istological and immunoistochemical techniques has been used to verify the complete decellularization of tissue and the organization of the Extracellular Matrix (ECM). Bovine fibroblasts (Pericardiocytes) and human endothelial cells (HUVEC) have then been seeded on serosal layer. Many seeding have been done in order to test different cellular densities and culture media. Spectrophotometric Landegren and MTT Tests and Haematoxylin and Eosin (H&E) have been carried on to check the seeding processes. At the same time others samples of BP UTRIDOC have been funzionalized with a syntethic, proadhesive peptide RGD sequence and Pericardiocytes have been seeded. TRITDOC protocol has been also applyed to CP and PP. These Pericardia have been collected and cutted in four anatomical areas: VsxANT, VdxANT, VsxPOST, VdxPOST. Density, thickness and water content HAVE been determined for each area and have been compared with non-tReated Pericardia. To check decellularisation and matrix preservation of these samples the following techniques have been applied: H&E, DAPI, immunohistochemistry and electron transmission microscopy (TEM). Removal of the xenoantigen alpha-Gal has been assessed by means of ELISA test. RESULTS: As been shown the three methods of decellularisation are able to remove cellular component from pericardial tissues and maintain ECM organization. Cellular seeding tests have showed Pericardiocytes adhesion on PB UTRIDOC serosal surface, after 6h and 18h of culture. Moreover, after 7 days Pericardiocyte begin to migrate into ECM of BP UTRIDOC e TRICOL maintaining an active metabolism. When using syntethic, proadhesive peptide RGD, Pericardiocytes better adhere to the BP UTRIDOC. HUVEC cells are able to adhere to the BP UTRIDOC in 1h, 3h, 5h and 24h since seeding, but they does not form a continous layer. However, they form it after 7 days on the BP TRITDOC and they keep espression of vWf and CD31. The whole TRITDOC CP display a significant decrease of water content (p0,05), while density significantly increased (p0,05) and a significant decrease in water content (p0,05). Moreover, for the mentioned above physical features, the VsxANT area in CP and VdxANT area in PP proved to be the most homogeneous specimens, compared to the other areas in the same species. Structural analyses demonstrated complete decellularisation in both CP and PP TRITDOC. Matrix architecture and collagen fibres organization were grossly maintained by the TRITDOC treatment, as exhibited by histology and TEM analysis. The xenoantigen alpha-Gal was completely removed from CP and PP after TRITDOC decellularisation. CONCLUSIONS: the tested decellularisation protocols, UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC, produce bovine and porcine pericardial scaffolds that are acellular, non-cytotoxic, and exhibit normal organisation of the ECM. The TRITDOC BP, seems to be suitable for cellular seeding of human endothelial cells HUVEC. TRITDOC decellularisation of CP and PP identified specific pericardial areas more prone for use in TEHV. Further studies should be carried out to assess the mechanical performances of such scaffold, prior and after in-vitro cell seedingPRESUPPOSTI DELLO STUDIO: Nel mondo occidentale la patologia valvolare cardiaca presenta una prevalenza del 2% nella popolazione generale, ed è in costante crescita dato l’invecchiamento della popolazione. La terapia chirurgica attuale utilizza sostituti valvolari meccanici e biologici, che frequentemente portano i pazienti al reintervento o all'insorgenza di complicanze. L'Ingegneria Tissutale (TE), disciplina che unisce il contributo dell'ingegneria e della biologia, potrebbe permettere di creare sostituti valvolari dotati di patrimonio cellulare autologo e vitale in grado di andare incontro a rimodellamento e crescita in accordo con lo stato fisiologico dei pazienti, in particolare quelli pediatrici. SCOPO DELLO STUDIO: Gli scopi di questo studio sono stati: verificare la capacità di decellularizzazione dei metodi UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC quando applicati al Pericardio Bovino (PB), al Pericardio Bovino di Vitello (PBV) e al Pericardio Porcino (PP); testare il potenziale di ricellularizzazione del PB UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC e caratterizzare strutturalmente e fisicamente il PBV e il PP prima e dopo decellularizzazione TRITDOC che si è rivelato un promettente metodo per l'adesione cellulare endoteliale. Gli scaffolds ottenuti sono stati valutati come biomateriali di base per l'Ingegneria Tissutale delle valvole cardiache (TEHV). MATERIALI E METODI: Il PB è stato decellularizzato utilizzando tre metodi denominati rispettivamente: UTRIDOC, TRICOL E TRITDOC. Verificata la completa decellularizzazione del tessuto e l'organizzazione della Matrice Extracellulare (MEC) tramite tecniche istologiche ed immunoistochimiche, sulla superficie sierosa del tessuto sono stati seminati fibroblasti bovini (Pericardiociti) e cellule endoteliali umane (HUVEC). Le semine sono state eseguite in diverse condizioni sperimentali per testare la densità cellulare più promettente e i terreni di coltura più adatti. I risultati delle semine sono stati indagati attraverso colorazione dei campioni con Ematossilina ed Eosina, Test di Landegren e Test MTT. Il PB UTRIDOC è stato successivamente funzionalizzato con una sequenza peptidica sintetica proadesiva RGD (arginina, glicina, acido aspartico), ed è stata testata l'adesione dei Pericardiociti. Il protocollo TRITDOC è stato poi applicato anche al PBV e al PP. In quest'ultimi esperimenti i pericardi sono stati espiantati dopo sacrificio degli animali e suddivisi in 4 aree anatomiche: VsxANT, VdxANT, VsxPOST, VdxPOST. Per ogni area dei pericardi trattati TRITDOC e non trattati sono stati determinati lo spessore, la densità e il contenuto d’acqua medi. La qualità della decellularizzazione e la preservazione delle matrici sono state valutate tramite istologia, DAPI, immunoistochimica (IHC) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). L'eliminazione dell'antigene xenogenico alpha-Gal dai PBV e dai PP TRITDOC, è stata valutata tramite test ELISA. RISULTATI: Tutti i metodi di decellularizzazione sono in grado di eliminare totalmente la componente cellulare dai tessuti pericardici, inoltre mantengono inalterata l'organizzazione generale della MEC. I test di semina cellulare hanno mostrato che i Pericardiociti aderiscono alla superficie sierosa del PB UTRIDOC dopo 6h e 18h dalla semina e cominciano ad entrare nella MEC dopo 7 giorni nel PB TRICOL e UTRIDOC, mantenendo un metabolismo attivo. In presenza del peptide proadesivo sintetico RGD, i pericardiociti aderiscono meglio al PB UTRIDOC anche utilizzando concentrazioni cellulari di semina minori. Le cellule HUVEC riescono ad aderire alla superficie sierosa del PB UTRIDOC se seminate per 1h, 3h, 5h e 24h, ma non formano un monostrato continuo. Dopo un tempo di 7 giorni dalla semina invece, aderiscono più uniformemente sul PB UTRIDCOC e formano un monostrato sul PB TRITDOC, mantenendo l'espressione dei marcatori endoteliali vWf e CD31. Considerando l’intero PBV, il trattamento TRITDOC causa una riduzione dello spessore (p>0,05), un incremento della densità (p0,05) e il contenuto d’acqua si è ridotto invece in maniera significativa (p0,05). Dopo decellularizzazione, la densità del PP non si è modificata significativamente (p>0,05) rispetto al tessuto nativo. Inoltre, le aree che ricoprono il VsxANT nel PB e il VdxANT nel PP sono risultate le più omogenee per le proprietà fisiche sopra menzionate, sia prima sia dopo decellularizzazione. Le analisi morfo-strutturali eseguite, l’istologia e la valutazione al TEM hanno rilevato una struttura della matrice e un’organizzazione delle fibre collagene sostanzialmente preservata dal trattamento TRITDOC. CONCLUSIONI: I protocolli di decellularizzazione UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC producono scaffolds pericardici bovini e porcini acellulari, non citotossici e con una MEC strutturalmente preservata. Il PB TRITDOC sembra lo scaffold più adatto per la semina di cellule umane endoteliali HUVEC. La decellularizzazione del PBV e del PP con il protocollo TRITDOC, ha inoltre permesso di individuare delle aree pericardiche di potenziale interesse per la TEHV. Studi approfonditi sulle prestazioni meccaniche e sul ripopolamento cellulare di queste matrici permetteranno una valutazione più accurata dell’effetto del trattament